鉀轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因OsHAKα和OsKβ與水稻耐鹽性的關(guān)系研究.pdf

1、K+是高等植物中重要的營(yíng)養(yǎng)元素，也是非鹽生植物中最豐富的無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，在植物許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，參與植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。植物鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)植物從土壤中積累和在不同植物組織內(nèi)的K+分布，根據(jù)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，可分為五個(gè)家族:Shaker通道、KCO通道、KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運(yùn)體、TrK/HKT轉(zhuǎn)運(yùn)體和K/H逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體。本文研究水稻HAK轉(zhuǎn)運(yùn)體OsHAKα和Shaker家族的OsKβ及其在水稻耐鹽中的作用。
　　利用OsHAK

2、α和OsKβ各自的突變體與相應(yīng)野生型在鹽脅迫時(shí)的表型，鉀鈉離子含量，死亡率，干鮮重等生理指標(biāo)，研究OsHAKα和OsKβ在水稻響應(yīng)鹽脅迫時(shí)的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OsHAKα的突變體在200mmol/LNaCl濃度下，種子的發(fā)芽時(shí)間延遲、發(fā)芽率降低70％，OsKβ的突變體在一定鹽濃度范圍內(nèi)(0-250mmol/L)，種子發(fā)芽率沒(méi)有明顯變化。鹽濃度在0-300mmol/L時(shí)，兩基因突變體突變體的根長(zhǎng)受低濃度鹽溶液刺激，有一定的增長(zhǎng)，高濃度鹽處理時(shí)

3、根長(zhǎng)生長(zhǎng)受抑制，在250mmol/LNaCl濃度下根長(zhǎng)長(zhǎng)度是對(duì)照WT苗的50％左右，兩基因突變體的苗高都受到NaCl溶液的抑制，在250mmol/LNaCl濃度苗高為對(duì)照苗的50％左右。120mmol/LNaCl濃度處理水稻苗8d，兩基因的突變體死亡率比相應(yīng)野生型死亡率高1.25倍左右，干重降低60％左右，鮮重降低75％左右。120mmol/LNaCl處理的0d至8d里，OsHAKα的突變體的Na+含量隨著天數(shù)的增加是升高的，K+含量隨

4、天數(shù)的增加是降低的，在第8d，Na+含量是相應(yīng)野生型的1.3倍，K+含量是相應(yīng)野生型的75％。OsKβ的突變體的NA+和K+含量隨著天數(shù)的變化不明顯，但該突變體表現(xiàn)出比相應(yīng)野生型高死亡率的明顯表型。這些結(jié)果表明OsHAKα和OsKβ兩個(gè)基因可能正向調(diào)節(jié)水稻抗鹽害能力。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究基因功能以及作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)基因在耐鹽中的作用，我們用RNA干擾的方法。首先，選取從OsHAKα3’端開(kāi)始加不同長(zhǎng)度

5、CDS的兩段不同長(zhǎng)度的特異性片段，從OsKβ3’端開(kāi)始加一定長(zhǎng)度CDS的基因片段，從OsKβ中間跨膜功能性區(qū)域選取特異性片段，共四段特異性片段。先利用水稻原生質(zhì)體為材料，快速研究基因功能的雙鏈RNA瞬時(shí)干擾體系，在最優(yōu)化的瞬時(shí)干擾系統(tǒng)條件下，將四個(gè)特異性片段連接T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，兩個(gè)基因可以在水稻原生質(zhì)體體內(nèi)瞬時(shí)被干擾沉默，OsHAKα的干擾率可以達(dá)到65％，OsKβ的干擾

6、率可以達(dá)到60％。四個(gè)片段轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體可明顯降低基因的表達(dá)水平。
　　其次，經(jīng)過(guò)瞬時(shí)干擾確定所選片段分別被插入表達(dá)載體pSuper1300所加入的PDK功能性?xún)?nèi)含子的兩端，構(gòu)建成了含有內(nèi)含子發(fā)卡結(jié)構(gòu)的ihpRNA表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用轉(zhuǎn)染水稻愈傷組織進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)抗性篩選和PCR檢測(cè)，得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株;半定量RT-PCR結(jié)果顯示所獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中，OsHAKα和OsKβ兩個(gè)基因表達(dá)量下降，表明該干擾載體能夠分別有效抑