C57BL小鼠腦增齡性改變和帕金森病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分：增齡和MPTP對C57BL小鼠運(yùn)動功能影響的行為學(xué)研究 目的：通過構(gòu)建不同增齡組C57BL小鼠1—甲基，4—苯基，1，2，3，6—四氫吡啶（1—methyl—4—phenyl—1，2，3，6—tetrahydropyridine，MPTP）毒性帕金森病模型，觀察小鼠運(yùn)動功能的增齡性變化和增齡對MPTP毒性行為學(xué)反應(yīng)的影響。 方法：分別構(gòu)建3、6、12、16、20月齡組C57BL小鼠，每組20只，雄雌各半。MPT

2、P30mg/kg．d—1腹腔注射，連續(xù)5天，構(gòu)建小鼠PD模型。分別在造模前、造模后第1、7、14和28天對各增齡組動物的行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)觀察。小鼠轉(zhuǎn)棒儀測定小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期；小鼠自發(fā)活動箱測定小鼠自發(fā)活動量；自制小鼠爬桿測定爬桿時間。 結(jié)果：6月齡小鼠表現(xiàn)出最長的轉(zhuǎn)棒潛伏期，顯著高于其他各組（P<0．05）12月齡后各組轉(zhuǎn)棒潛伏期降低至3月齡水平。6月齡小鼠較其它各組亦表現(xiàn)出較短的爬桿時間（P<0．05）。12月齡組表現(xiàn)出最多的

3、自發(fā)活動量。各組動物在MPTP腹腔注射后均立即出現(xiàn)少動、豎尾和激惹等急性期反應(yīng)。成模后第一天各組均出現(xiàn)轉(zhuǎn)棒潛伏期的明顯縮短，爬桿時間的延長和自發(fā)活動量的顯著減少。對各增齡組動物行為學(xué)指標(biāo)的連續(xù)觀察顯示：3、6月齡小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期和爬桿時間均在成模后第14天已有明顯恢復(fù)，而12月齡以上各組卻恢復(fù)緩慢，甚至在第28天仍未完全恢復(fù)。各增齡組自發(fā)活動在一過性降低后均與一周后恢復(fù)。 結(jié)論：增齡對C57BL小鼠運(yùn)動功能存在顯著影響，6月齡后C

4、57BL小鼠運(yùn)動功能表現(xiàn)處隨齡性衰退；MPTP可明顯影響C57BL小鼠運(yùn)動功能，12月齡以上小鼠對MPTP毒性表現(xiàn)處較高的行為學(xué)敏感性。 第二部分：增齡和MPTP對C57BL小鼠黑質(zhì)—紋狀體多巴胺能神經(jīng)元、多巴胺代謝和氧化應(yīng)激的影響 目的： C57BL小鼠運(yùn)動功能存在隨齡性改變，12月齡以后小鼠運(yùn)動功能明顯衰退，而且在MPTP處理后老齡小鼠亦表現(xiàn)出更加明顯的行為學(xué)改變，其代償能力明顯低于低齡組。為探討這一現(xiàn)象相應(yīng)的解剖病

5、理基礎(chǔ)及與黑質(zhì)—紋狀體系統(tǒng)多巴胺（Dopamine，DA）代謝之間存在的聯(lián)系。 方法：雄性C57BL小鼠，分別構(gòu)建3、6、12、16、20月齡組，每組20只。分為自然增齡組和PD模型組，MPTP30mg/kg．d—1腹腔注射，連續(xù)給藥5天，建模。小鼠黑質(zhì)連續(xù)切片，酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）免疫組織化學(xué)染色并計(jì)數(shù)TH陽性細(xì)胞數(shù)。高效液相色譜法檢測紋狀體DA水平?；瘜W(xué)比色法檢測紋狀體組織總活性氧。

6、 結(jié)果：在自然增齡過程中，小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)以6月齡組為最高，各組與6月齡組相比較顯示：3月齡組低于6月齡組（P<0．05）；16、20月齡組均顯著低于6月齡組（P<0．01）。經(jīng)MPTP處理各組TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低（P<0．01），各月齡組TH陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)下降的百分比分別為：28．3%（3月齡）；29．5%（6月齡）；35．0%（12月齡）；43．7%（16月齡）和60．3%（20月齡）。自然增齡各組紋狀體DA水平

7、未見顯著差異。MPTP處理各組紋狀體DA水平均見顯著降低，尤以12、16和20月齡老齡各組為著。自然增齡各組紋狀體總活性氧水平在12月齡以上各組明顯升高，MPTP處理后各組總活性氧水平均顯著升高。 結(jié)論：增齡過程中C57BL小鼠黑質(zhì)DA能細(xì)胞計(jì)數(shù)和紋狀體DA水平下降；而氧化應(yīng)激水平升高：MPTP在12月齡以上小鼠引起更加嚴(yán)重的黑質(zhì)—紋狀體DA能系統(tǒng)損害；老齡小鼠對MPIP的高敏感性可能和紋狀體氧化應(yīng)激水平的增齡性升高及抗氧化能力

8、下降有關(guān)。 第三部分：C57BL小鼠紋狀體DAT、VMAT—2和a—Synuclein表達(dá)的增齡模式和對MPTP毒性的反應(yīng) 目的：為進(jìn)一步觀察增齡過程中C57BL小鼠紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（Dopamine transporter，DAT）、2型囊泡單胺類轉(zhuǎn)運(yùn)體（Vesicular membrane monoamine transporter type2，VMAT—2）和a—突觸核蛋白（a—Synuclein）表達(dá)的變化是否

9、參與老齡小鼠對外源毒素高敏感性的內(nèi)在機(jī)制。 方法：雄性C57BL小鼠，分別構(gòu)建3、6、12、16、20月齡組，每組20只。分為自然增齡組和PD模型組，MPTP30mg/kg．d—1腹腔注射，連續(xù)給藥5天，建模。分別以Western—blotting和Real—time PCR法檢測自然增齡和MPTP處理各組紋狀體DAT、VMAT—2及a—Synuclein蛋白表達(dá)及mRNA水平。 結(jié)果：自然增齡過程DAT總蛋白水平在各增

10、齡組間無顯著差異，MPIP處理各增齡組DAT表達(dá)水平均較同齡非給藥組見明顯下降，但以16、20月齡組稍明顯，組間差異有顯著性，P<0．05；12月齡后小鼠紋狀體VMAT—2表達(dá)水平明顯下降，組間差異有顯著性，P<0．05；經(jīng)MPTP處理各增齡組VMAT—2較同齡非給藥組有明顯下降P<0．05，但給藥后各組組間差異無顯著性；DAT和VMAT—2蛋白表達(dá)量的比值在6月齡后呈隨齡性降低；a—Synuclein的表達(dá)呈隨齡增高趨勢，老齡小鼠紋狀

11、體a—Synuclein表達(dá)量高于低齡組，組間差異有顯著性（P<0．05）；MPTP處理后各增齡組a—Synuclein表達(dá)較同齡非給藥組明顯上調(diào)，各組與非給藥組相比有顯著差異（P<0．01）。DAT mRNA水平在自然增齡各組未見顯著差異，經(jīng)MPTP處理后16、20月齡組較同齡非給藥組出現(xiàn)異常顯著的增高，16月齡組P<0．05，20月齡組P<0．01。VMAT—2 mRNA水平在自然增齡過程中呈現(xiàn)明顯下降趨勢，各增齡組間比較差異有顯著

12、性，P<0．05。MPTP給藥后3、16和20月齡組mRNA水平較同齡非給藥組出現(xiàn)顯著升高，3月齡組P<0．05，16、20月齡組P<0．01。a—Synuclein mRNA水平在自然增齡各組間未見顯著差異，但在MPTP處理各組mRNA水平均較同齡的非給藥組升高，P<0．05。 結(jié)論： C57BL小鼠DAT、VMAT—2和a—Synuclein表達(dá)存在增齡性變化。高齡小鼠DAT，VMAT—2表達(dá)的失衡狀態(tài)可能介導(dǎo)紋狀體多巴胺能

13、神經(jīng)元的高易損性。老齡小鼠MPTP毒性反應(yīng)中，DAT、VMAT—2和a—Synuclein在其中發(fā)揮重要作用。 第四部分：多巴胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對轉(zhuǎn)人a—Synuclein基因PC12細(xì)胞的影響 目的：為探討a—Synuclein在多巴胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用。 方法：利用轉(zhuǎn)人a—Synuclein的PC12細(xì)胞，給予多巴胺150μM處理12h。MTT法檢測細(xì)胞活力：AnnexinV—PI染色檢測細(xì)胞凋亡；激光共聚

14、焦顯微鏡下觀察a—Synuclein表達(dá)情況；免疫組織化學(xué)檢測各處理組a—Synuclein表達(dá)情況。 結(jié)果： DA處理（150μM，12h）可顯著降低各株細(xì)胞的存活率（P<0．01），但轉(zhuǎn)人SNCA—pEGFP—C3 PC12細(xì)胞表現(xiàn)出相對較輕的抑制率。DA處理組細(xì)胞凋亡明顯增多，但鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)人SNCA—pEGFP—C3 PC12細(xì)胞凋亡數(shù)量相對較少。轉(zhuǎn)人SNCA—pEGFP—C3 PC12細(xì)胞在給予DA（150μM）后第

15、7分鐘開始各感興趣區(qū)熒光強(qiáng)度開始上升，并在給藥后30分鐘內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度一直持續(xù)至給藥后4小時。DA處理后，PC12細(xì)胞和轉(zhuǎn)入SNCA—pEGFP—C3 PC12細(xì)胞均出現(xiàn)a—Synuclein的高表達(dá)，轉(zhuǎn)人SNCA—pEGFP—C3 PC12細(xì)胞DA處理后a—Synuclein表達(dá)增強(qiáng)，但以外源性a—Synuclein上調(diào)為主。兩株細(xì)胞在未給藥狀態(tài)下a—Synuclein表達(dá)于胞漿，免疫陽性著色呈均勻散在分布；在DA處