TLR2活化對HBV持續(xù)復制的影響及其機制研究.pdf

1、目的:
　　1.在HBV慢性復制小鼠模型中,探索TLR2活化能否抑制體內(nèi)HBV復制。
　　2.在HBV慢性復制小鼠模型中,探討TLR2活化抑制HBV復制的機制。
　　方法:
　　1.TLR2配體Pam3CSK(P3C)小鼠尾根皮下注射。在不同時間點,定量ELISA檢測小鼠血清中炎癥因子:IL-6、TNF-α和IL-1β等的表達。
　　2.C57BL/6小鼠高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立慢性HB

2、V復制小鼠模型。在pAAV/HBV1.2質(zhì)粒注射后的早期(day0,day7和day14)或晚期(day14,day21和day28),連續(xù)3次尾根皮下注射P3C處理小鼠。
　　3.按既定實驗設計對小鼠進行眼眶采血,并在固定時間點留取肝脾組織樣本。通過定量ELISA檢測小鼠血清炎癥因子(IL-6、TNF-α和IL-1β等)和HBV血清標志物(如HBsAg、HBeAg);用免疫組織化學方法檢測肝組織中HBcAg的表達;用realti

3、mePCR和realtimeRT-PCR分別檢測血清中HBVDNA水平和肝組織相關分子mRNA的表達水平;用ELISPOT檢測脾淋巴細胞中抗原特異性的分泌IFN-γ的細胞數(shù);通過細胞內(nèi)因子染色檢測PBMCs和脾淋巴細胞中HBs/HBcpeptide特異性的分泌IFN-γ的CD8+T細胞陽性百分率;用Dimer染色檢測脾細胞中HBs/HBcpeptide特異性的CTLs情況。
　　4.使用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,使用Gr

4、aphPadPrism5作圖。
　　結(jié)果:
　　1.naive小鼠和HBV慢性復制小鼠經(jīng)尾根皮下注射P3C后,血清中IL-6的產(chǎn)生在注射后3h達到最高,在24h內(nèi)降至正常水平。并且,血清中IL-6的表達水平與P3C的處理劑量成正相關。
　　2.HBV慢性復制小鼠經(jīng)早期應用P3C后,血清中HBsAg、HBeAg及HBVDNA水平明顯降低,小鼠肝內(nèi)HBcAg的表達也顯著減少。而在P3C晚期處理小鼠中,未發(fā)現(xiàn)明顯的抗HBV效

5、應。
　　3.在早期應用P3C組和未處理組的小鼠中,脾淋巴細胞和PBMCs均未能檢測到HBV特異性的細胞免疫應答。僅在第10天,早期應用P3C組小鼠的脾淋巴細胞經(jīng)rHBcAg刺激后分泌IFN-γ的T細胞數(shù)量少于對照組。
　　4.通過對小鼠肝組織相關分子mRNA水平進行realtimeRT-PCR檢測,我們發(fā)現(xiàn):早期應用P3C組和對照組小鼠相比,IFN-β和IFN-γmRNA無明顯差異;促炎因子IL-6和TNF-αmRNA在第

6、4天明顯高于對照組;抑炎因子IL-10mRNA在第4天和第10天明顯高于對照組。
　　結(jié)論:
　　1.naive小鼠和HBV慢性復制小鼠經(jīng)TLR2配體P3C處理后,血清IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生是一個較快的過程,一般在幾個小時內(nèi)達到最高峰,且炎癥因子的濃度與P3C的劑量成正相關。
　　2.在慢性HBV復制小鼠模型中,早期應用P3C能發(fā)揮明顯的抗HBV效應,而晚期應用則無此明顯效應。
　　3.在慢性HBV復制小鼠模型