左氧氟沙星在大鼠胃黏膜體外模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)特征及可能參與的載體蛋白相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　采用大鼠胃黏膜與Ussing chamber技術(shù)建立胃黏膜體外模型研究左氧氟沙星在體外模型中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特征，并評(píng)價(jià)藥物濃度、時(shí)間、方向、pH值、P-糖蛋白抑制劑(維拉帕米、環(huán)孢素A)及有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑(西咪替丁)對(duì)左氧氟沙星跨胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　方法：
　　1、建立左氧氟沙星跨胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)體外模型
　　Wistar大鼠術(shù)前禁食24小時(shí)，麻醉后開(kāi)腹，將新鮮胃迅速?gòu)母骨恢腥〕觯⑹褂蒙睇}水對(duì)漿膜

2、面充分清洗，自胃小彎沿軸向剖開(kāi)，黏膜面在4℃Krebs-ringer液中輕柔漂洗后，使用水泡法將腺體部分未損壞的胃黏膜層與黏膜下層分離，然后將黏膜層小心地安裝在尤斯擴(kuò)散池中間的插口內(nèi)固定，膜兩側(cè)擴(kuò)散池中加入37℃、pH=7.4的Krebs-Ringer液6mL，并通入CO2/O2（5％/95％）混合氣體。待此條件下平衡30min后，將溶液換成新鮮 Krebs-Ringer液，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　2、左氧氟沙星跨胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究

3、>　　(1)評(píng)價(jià)濃度及方向?qū)ψ笱醴承强缥葛つまD(zhuǎn)運(yùn)的影響實(shí)驗(yàn)
　　吸收方向(黏膜側(cè)到漿膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，M-S)實(shí)驗(yàn)：于M側(cè)和S側(cè)分別加入Krebs-Ringer液6ml。M側(cè)加入左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度分別達(dá)10、25、50、100、150μg/mL，并分別于20，40，60，80，100，120，140，160min時(shí)于S側(cè)取200μl樣品，每次取樣后補(bǔ)充200μL Krebs-Ringer液。使用高效液相色譜法檢測(cè)各個(gè)樣本中左

4、氧氟沙星濃度。分泌方向(漿膜側(cè)到黏膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)，S-M)實(shí)驗(yàn)：S側(cè)加入左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，余同吸收方向?qū)嶒?yàn)。
　　(2)評(píng)價(jià)不同的載體蛋白抑制劑對(duì)胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響實(shí)驗(yàn)
　　M-S：M側(cè)加入含左氧氟沙星50μg·mL-1與載體蛋白抑制劑的Krebs-Ringer液6 mL，S側(cè)加入空白Krebs-Ringer液6mL。于20，40，60，80，100，120，140，160min時(shí)從S側(cè)各取樣品200μL，每次取樣后補(bǔ)充200μL

5、 Krebs-Ringer液，使用高效液相色譜法檢測(cè)各個(gè)樣本中左氧氟沙星濃度。S-M：M側(cè)加入含載體蛋白抑制劑的Krebs-Ringer液6 mL，S側(cè)加入含左氧氟沙星50μg·mL-1的Krebs-Ringer液6mL，余同M-S。
　　(3)評(píng)價(jià)pH對(duì)胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響實(shí)驗(yàn)
　　將Krebs-ringer液pH值分別調(diào)至4.0、7.4、8.0，重復(fù)上述M-S轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。
　　3、建立左氧氟沙星檢測(cè)的HPLC方法

6、　　各個(gè)時(shí)間段樣本經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，使用HPLC進(jìn)行左氧氟沙星濃度檢測(cè)，HPLC條件：流動(dòng)相為乙腈-50mmol·L-1檸檬酸溶液-1mol·L-1醋酸銨溶液(17:82:1；v/v/v)，Welch C18分析柱，流速1.0mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)295nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL。評(píng)價(jià)專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、回收率、精密度、穩(wěn)定性。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)研究左氧氟沙星跨大鼠胃黏膜體外模型轉(zhuǎn)運(yùn)方式中所涉及的胃黏膜剝離方法

7、、Ussing chamber技術(shù)以及本實(shí)驗(yàn)所用的HPLC對(duì)左氧氟沙星的檢測(cè)方法穩(wěn)定、可靠。
　　2、左氧氟沙星跨大鼠胃黏膜雙向累積透過(guò)量均隨時(shí)間的增加而增加，各個(gè)濃度的左氧氟沙星分泌方向累計(jì)透過(guò)量均大于其吸收方向的累計(jì)透過(guò)量。各個(gè)濃度的左氧氟沙星累積透過(guò)量之間以及各個(gè)濃度的左氧氟沙星表觀(guān)滲透系數(shù)之間比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；各個(gè)濃度的左氧氟沙星分泌方向累計(jì)透過(guò)量均大于其吸收方向的累計(jì)透過(guò)量。不同濃度的左氧氟沙星分泌方向P

8、app明顯大于吸收方向Papp，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3、左氧氟沙星(50μg·mL-1)在pH為4.0、7.4、8.0時(shí)的P app值分別為(0.95±0.07)，(1.60±0.11)，(1.37±0.24)，Papp值在pH為7.4時(shí)最大，pH=4時(shí)的Papp值明顯小于pH=7.4時(shí)(P<0.01)，pH=8.0時(shí)Papp值小于pH=7.4(P>0.05)。
　　4、加入環(huán)孢素A后左氧氟沙星（50

9、ug/mL）Papp(S-M)/Papp(M-S)由2.20變?yōu)?.06(P<0.05)；加入維拉帕米后左氧氟沙星（50ug/mL）Papp(S-M)/Papp(M-S)由2.20變?yōu)?.08(P<0.01)；加入西咪替丁后左氧氟沙星(50ug/mL) Papp(S-M)/Papp(M-S)由2.20變?yōu)?.78(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、剝離大鼠胃黏膜是本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中所采用的水泡法能夠達(dá)到藥物跨膜轉(zhuǎn)

10、運(yùn)研究的技術(shù)要求。
　　2、不同濃度的左氧氟沙星跨大鼠胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)的累積透過(guò)量及Papp均具有顯著的方向性差異，且有一定的pH依賴(lài)性，并且P-糖蛋白抑制劑環(huán)孢素A及維拉帕米可增加左氧氟沙星的吸收，減少左氧氟沙星的分泌。表明左氧氟沙星在大鼠胃黏膜體外模型中可能以載體蛋白介導(dǎo)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，P-糖蛋白可能參與左氧氟沙星跨胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。
　　3、有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑西咪替丁對(duì)左氧氟沙星跨胃黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)顯著影響，間接說(shuō)明有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)