丹參酮ⅡA調(diào)節(jié)電壓依賴鉀通道抑制大鼠慢性低氧性肺動脈高壓.pdf

1、研究背景：
　　低氧性肺動脈高壓（HPH）是指由慢性阻塞性肺病、久居高原等導(dǎo)致的長期缺氧所引起的以肺動脈壓力持久性升高為典型特征的心肺循環(huán)功能紊亂，可誘發(fā)一系列病理生理過程，肺動脈壓升高導(dǎo)致肺動脈主干擴(kuò)張、右心負(fù)荷加重，出現(xiàn)右心室肥厚、擴(kuò)張，嚴(yán)重影響心臟功能，致殘率、死亡率均較高。目前尚無特效的防治手段，因此尋找有效防治該疾病的新方法、新藥物已成為擺在醫(yī)學(xué)科研工作者面前的一個重大課題，亟待解決。
　　丹參是一種具有悠久歷史的

2、傳統(tǒng)中藥，已被單獨或聯(lián)合其他藥物廣泛應(yīng)用于臨床。丹參酮是丹參中含有的一系列松香烷雙萜化合物，其中以丹參酮ⅡA（TⅡA）含量最為豐富，且具有丹參的大部分功效。我課題組已證實TⅡA可有效防治慢性HPH，并初步探索了其作用機(jī)制，證實TⅡA可通過抑制PASMCs增殖、降低肺組織中內(nèi)皮素1水平、抑制氧化應(yīng)激水平減輕慢性HPH，但有關(guān)TⅡA防治HPH的機(jī)制仍有待深入探討。
　　實驗?zāi)康模?br>　?。?）證實TⅡA對慢性HPH大鼠的防治作用；

3、
　?。?）觀察TⅡA對肺動脈平滑肌細(xì)胞Kv1.5、Kv2.1表達(dá)的影響；
　?。?）探討TⅡA對肺動脈平滑肌細(xì)胞Kv通道功能的影響；
　　（4）明確TⅡA對HPH的防治作用和Kv通道是否有關(guān)。
　　實驗方法：
　?。?）動物實驗：
　　實驗動物、分組及模型復(fù)制
　　健康雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量200-250g。將其隨機(jī)分為4組（每組8只）：正常對照組（Controlgroup）、TⅡA對照組（

4、TⅡAgroup）、模型組（HPHgroup）及防治組（HPH/TⅡAgroup）。模型組、防治組大鼠每日置于低氧艙中低氧8h，低氧艙氣壓380mmHg，正常對照組、TⅡA對照組同法飼養(yǎng)，TⅡA對照組、防治組每日入艙前腹腔注射TⅡA(10mg/kg)，1次/日，直至實驗結(jié)束（28天），正常對照組、模型組同法給予等量生理鹽水。
　　觀察指標(biāo)
　　①經(jīng)右頸外靜脈及左頸總動脈測量右心室收縮壓峰值（RVPSP）及平均頸總動脈壓（mC

5、AP）。處死大鼠后測量右心室肥厚指數(shù)并行肺組織HE染色，觀察肺組織病理學(xué)變化并利用圖像分析軟件計算血管管壁面積占其總面積的百分比（MA％）及血管管壁厚度占其外徑的百分比（MT％）。上述指標(biāo)可客觀反應(yīng)慢性HPH的輕重程度，可從多角度觀察TⅡA對慢性HPH大鼠的防治作用。
　?、诶肳esternblotting、RT-PCR技術(shù)測定各組肺小動脈組織中Kv1.5、Kv2.1蛋白及mRNA的水平，比較各組間差異。
　　③急性分離大

6、鼠肺小動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs），用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察TⅡA對慢性HPH大鼠PASMCs電壓依賴性鉀電流（Ikv）的影響。
　?。?）血管環(huán)實驗
　　實驗動物同上。制備肺動脈三級分支血管環(huán)，利用生物信號采集系統(tǒng)記錄不同條件下的血管張力。實驗分為低氧組(Hypoxiagroup)、TⅡA預(yù)處理組(TⅡA+Hypoxiagroup)、TⅡA+4-氨基吡啶（4AP）預(yù)處理組(TⅡA+4AP+Hypoxiagroup)。TⅡA

7、預(yù)處理組加苯腎上腺素(phenylephrine,PE)前給予TⅡA(10-5M)預(yù)處理20min，TⅡA+4AP預(yù)處理組加PE前給予TⅡA(10-5M)、4-AP(10-6M)預(yù)處理20min，低氧組給予等量生理鹽水。預(yù)處理后先給予PE（10-6M），待其張力達(dá)到平臺期并穩(wěn)定后，創(chuàng)造低氧環(huán)境，繼續(xù)記錄其張力變化1h以上。
　　（3）細(xì)胞實驗
　　急性分離正常大鼠PASMCs。實驗分為正常對照組（Controlgroup）、

8、TⅡA對照組（TⅡAgroup）、低氧組（Hypoxiagroup）及防治組（Hypoxia/TⅡAgroup）。對照組、TⅡA對照組浴槽中持續(xù)通入氧飽和的細(xì)胞外液，1ml/min，低氧組、防治組將所通氣體換為低氧外液，TⅡA對照組、防治組細(xì)胞外液加入TⅡA，終濃度為25mg/L，對照組、模型組加入等量生理鹽水。低氧1小時后利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測細(xì)胞鉀電流。
　?。?）統(tǒng)計學(xué)分析
　　用spss軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x

9、±SE形式表示。組間比較用one-wayANOVA及l(fā)eastsignificantdifferenced（LSD）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果：
　?。?）TⅡA對慢性HPH大鼠血流動力學(xué)及右心肥厚指數(shù)的影響
　　與正常對照組相比，模型組RVPSP、RVHI均顯著升高（P<0.05），TⅡA防治后上述兩項指標(biāo)均較模型組顯著降低（P<0.05），TⅡA對照組這兩項指標(biāo)較正常對照組無明

10、顯改變。提示：TⅡA可降低HPH大鼠肺動脈壓力并減輕其右心室肥厚程度。mCAP記錄結(jié)果顯示慢性低氧及TⅡA對大鼠mCAP無顯著影響。
　?。?）TⅡA對慢性HPH大鼠肺小動脈組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化的影響
　　將肺組織HE染色后模型組大鼠鏡下可見肺泡點片狀出血、肺泡內(nèi)可見滲出物，肺小動脈管腔明顯狹窄，管壁顯著增厚，以肌層增厚為主，TⅡA防治組前述病理變化較模型組顯著減輕，TⅡA對照組鏡下表現(xiàn)與正常對照組無明顯差異。利用圖像分析軟件

11、計算MA％及MT％發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，模型組MA％、MT％均升高（P<0.05），TⅡA防治組MA％、MT％均較模型組顯著降低（P<0.05），TⅡA對照組的MA％、MT％與正常對照組比較無明顯改變。綜上，TⅡA可顯著減輕慢性HPH大鼠肺小動脈的組織病理學(xué)變化，減輕慢性低氧導(dǎo)致的肺小動脈壁增生。
　　（3）TⅡA對慢性HPH大鼠肺小動脈Kv1.5、Kv2.1蛋白表達(dá)水平的影響
　　與正常對照組相比，模型組肺小動脈Kv1.

12、5、Kv2.1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），TⅡA防治組上述兩種蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），TⅡA對照組蛋白表達(dá)水平與正常對照組無明顯差異。提示：TⅡA可以顯著減輕慢性低氧對肺小動脈Kv1.5、Kv2.1蛋白表達(dá)的抑制。
　?。?）TⅡA對慢性HPH大鼠肺小動脈Kv1.5、Kv2.1mRNA表達(dá)水平的影響
　　與正常對照組相比，模型組肺小動脈Kv1.5、Kv2.1mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05

13、），TⅡA防治后上述mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），TⅡA對照組mRNA表達(dá)水平與正常對照組無明顯差異。提示：TⅡA可以顯著減輕慢性低氧對肺小動脈Kv1.5、Kv2.1mRNA表達(dá)的抑制。
　?。?）TⅡA對慢性HPH大鼠PASMCs鉀電流的影響
　　與正常對照組相比，模型組PASMCs鉀電流密度明顯降低（P<0.05），TⅡA處理后PASMCs鉀電流密度較模型組顯著升高（P<0.05），但仍低于正常對照組，TⅡ

14、A對照組PASMCs鉀電流密度與正常對照組比較無明顯差異。提示：慢性低氧可降低PASMCs鉀電流密度，TⅡA可以顯著減輕慢性低氧的上述作用。
　　（6）TⅡA對急性低氧性肺動脈平滑肌舒縮功能變化的影響及其可能機(jī)制
　　肺小動脈血管環(huán)被苯腎上腺素（PE）刺激后張力很快升高，并逐漸達(dá)平臺期，穩(wěn)定后給予低氧處理，低氧后血管環(huán)表現(xiàn)出雙相收縮特性，第一相為一短暫的收縮期，繼之血管環(huán)出現(xiàn)一舒張反應(yīng)，稱之為最大舒張反應(yīng)，最后出現(xiàn)一長時程、

15、逐漸增強(qiáng)的血管收縮反應(yīng)，稱為II相血管收縮。TⅡA預(yù)處理可消除低氧所致的第一相短暫收縮、增強(qiáng)血管環(huán)舒張反應(yīng)程度、減小II相血管收縮程度并縮短其時間、使血管在II相血管收縮期后出現(xiàn)舒張反應(yīng)，4AP可阻斷除―消除第一相短暫收縮‖外的TⅡA的上述所有作用，提示TⅡA主要通過鉀通道作用于血管環(huán)。
　?。?）TⅡA對急性低氧PASMCs鉀電流的影響
　　與正常對照組相比，急性低氧組PASMCs鉀電流密度明顯降低，防治組PASMCs鉀電

16、流密度較模型組顯著升高，但仍低于正常對照組，TⅡA對照組PASMCs鉀電流密度與正常對照組無明顯差異。提示：急性低氧可降低PASMCs鉀電流密度，TⅡA可以顯著減輕急性低氧的上述作用。
　　結(jié)論：
　?。?）TⅡA可顯著減輕大鼠慢性HPH嚴(yán)重程度；
　?。?）TⅡA在mRNA、蛋白兩個水平均可減輕慢性低氧導(dǎo)致的肺小動脈平滑肌Kv1.5、Kv2.1表達(dá)抑制；
　　（3）TⅡA可顯著減輕急、慢性低氧對PASMCsIK