pHBcΔ-HBs“a”決定簇嵌合質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)及免疫效果的初步評價(jià).pdf

1、目的:該課題旨在利用乙肝病毒核心顆粒可以作為類病毒顆粒載體的特點(diǎn),將位于其刺突表面的主要免疫顯性區(qū)替換為HBsAg 100~162aa,即"a"決定簇部分的編碼序列,將含此嵌合基因的質(zhì)粒作為免疫原,以提高機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答水平,打破機(jī)體對HBV的特異性免疫耐受狀態(tài),尋找效果更佳的基因疫苗,從而為尋求有效的慢性乙肝治療性疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).方法:我們應(yīng)用PCR技術(shù),分別擴(kuò)增編碼乙肝病毒HBsAg 100~162aa部分、HBcAg 1~7

2、8aa部分和HBcAg 83~144aa的核苷酸序列,利用所引入的限制酶位點(diǎn)依次在體外連接后定向克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3的多克隆位點(diǎn)內(nèi).將嵌合基因亞克隆到原核表達(dá)載體pRSET-B內(nèi),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),利用鎳離子親合層析純化融合蛋白,并通過ELISA和western blot方法檢測融合蛋白的抗原性.將真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染倉鼠腎(BHK)細(xì)胞,通過間接免疫熒光法檢測表達(dá)產(chǎn)物的抗原性.分別用真核表達(dá)質(zhì)粒和純化融合蛋白免疫BALB/c

3、小鼠,加強(qiáng)免疫并定期采血,檢測血清中特異性抗體并進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以評價(jià)免疫的體液和細(xì)胞應(yīng)答效果.結(jié)論:1.所構(gòu)建的真核表達(dá)嵌合質(zhì)粒作為基因疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)效價(jià)的HBsAb,而不引起較強(qiáng)的HBcAb應(yīng)答.同時(shí)獲得了較強(qiáng)的HBsAg和HBcAg特異性的細(xì)胞應(yīng)答.因而有可能作為慢性乙肝治療性基因疫苗的候選疫苗,并具有一定的應(yīng)用前景.2.原核表達(dá)的融合蛋白作為疫苗沒有優(yōu)勢.3.基因疫苗較蛋白疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答方面具有不可比擬的優(yōu)勢.