小麥根tanrt2.1基因的抗原決定簇片段與原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在e.coli中的誘導(dǎo)和純化

1、首都師范大學(xué)碩士學(xué)位論文小麥根TaNRT2.1基因的抗原決定簇片段與原核表達(dá)載體的構(gòu)建及在E.coli中的誘導(dǎo)和純化姓名：李高巖申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：印莉萍20040501首都師范大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要A b s t r a c tI n r e c e n ty e a r s ，m a n yh i g ha f f i n i t y n i t r a t et r a n s p o r t e rg e

2、 n eW a Sc l o n e df r o mp l a n t s ．F o re x a m p l e ：B n N R T 2 f r o m B r a s s i c a n a p u s 、N R r Z m p f r o m N i c o t i a n a p l u m b a g i n i f o l i a 、A t N R T 2 』a n d A t N R T 2 2 f r o m A r

3、 a b i d o p s i s t h a l a i a n a 、G m N R T 2 f r o m G l y c i n em “、B C H l a n d B C H 2 f r o mH o r d e u m v a l g a r e ．a(chǎn) n d L e N r t l - Ja n d L e N r t l - 2 f r o m L y c o p e r s i c o ne s c u l e n

4、 l u m e t c 。T h e f i n a lp u r p o s eo f o u rs t u d yW S , St os u b l o c a l i z et h ep r o d u c to f t h eh i g l la f f i n i t y n i t r a t et r a n s p o r t e r g e n e ·T a N R T 2 ．1 ，w h i c h W

5、a S c l o n e d b y o u r l a b o r a t o r y f r o m T r i t i c u m a e s t i v u m ．A c c o r d i n g t ot h e a m i n o a c i ds e q u e n c e w h i c h W a S e n c o d e d b y t h eT a N R T 2 ．t ，w ef o u n d af r

6、a g m e n tw h i c hW a Sc o n s i d r e dh a dt h eh i g h e s ta n t i g e n i c i t y ．A n dt h i sf r a g m e n tW a Sn a m e db yA g ．T h ec o r r e s p o n d i n ge D N A s e q u e n c eo ft h i s f r a g m e n tW

7、a Sd e s i g n e da g a i na c c o r d i n gt o t h ec o d o n sw h i c h w a s p r e f e r r e d b y t h eE c o l i 。a n dW a s s y n t h e s i z e db y t h eS B S G e n e t e c h C o ．，L t d ．T h e n ，t h i sf r a g m

8、e n t W a S c l o n e d t o t h ef u s i o np r o t e i n e x p r e s s i o n v e c t o r p O E X _ 2 T ．T h e e a r l ys t a g eo f m yw o r k w e n t v e r yw e l l ：lc l o n e dA g f r a g m e n ti n t ot h ef u s i o

9、 np r o t e i ne x p r e s s i o n v e c t o r p G E X ·2 T ' t h a t w a s p G E X - 2 T - A g f o r s h o r t ，a n d t h e n c o n s t r u c t e d t h er e c o m b i n a n tp i a s m i ds u c c e s s f u l l y

10、 ．T h ev e c t o rp G E X - 2 T h a sa g l u t a t h i o n e —S - t r a n s f e r a s e ( G S T )g e n e ，w h i c hW a s i nf a v o ro f t h ep u r i f i c a t i o no f t h ef u s i o np r o t e i ns u b s e q u e n t l

11、y ．A n dt h e r ei s at h r o m b i ns i t ea tt h ee n d o f t h eG S T ．w h i c hw a s i nf a v o ro f t h es e p a r a t i o no f t h et a r g e tp r o t e i nf r o mt h em i x t u r ef u s i o np r o t e i ni nE ．c o

12、 i l ．T l l 酷eh a v eb e e nt h ef o u n d a t i o no f t h ep r o d u c t i o no fa n t i b o d y , a n dW e s t e r nb l o t t i n gt o o ．Ih a di n d u c e dt h ee x p r e s s i o no f t h ef u s i o np r o t e i nb y

13、t h ei n d u c t i o n o f I P T G ．B u t n o w , I e n c o u n t e r e d a d i f f i c u l tp r o b l e m ：t h ef u s i o np r o t e i nh a s b e c o m e t h ei n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d yf o rt h eo v e r *

14、 e x p r e s s i o n ．T h i sm a k e st h ep u r i f i c a t i o no f f u s i o np r o t e i nW a s i m p o s s i b l e 。I tW a s n o t r e s o l v e d y e t 。a l t h o u g hIh a d t r i e db y m a n y d i f f e r e n t

15、w a y s ．A t t h es a m c t i m e ．Im a k e u s co f t h e n e t w o r k r e s o u l v ．, e ss u f f i c i e n t l y ．1a n a l y s i sa n d p r e d i c t t h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h eT a N R T 2 ．1 ．A n dI

16、 m a k e ac o n c l u s i o nt h a tT a N R T 2 ．1 i s t h em e m b r a n ep r o t a l n ，a n dh a s1 2 t r a n s m e m b r a n e h e l i x e s b ym a n y d i f f e r e n tm e t h o d s ．A n dI a n a l y s i st h ea m i

17、n oa c i dc o m p o s i t i o n t h o r o u g h l y , a n d p r e d i c t t h es e c o n d a r y s t r u c t u r ea n d t e r t i a r ys t r u c t u r et o o ．K e yW o r d s ：h i g ha f f i n i t y n i t r a t et r a n s