NMDA受體亞單位2B在局灶性腦缺血后腦室下區(qū)神經(jīng)發(fā)生中作用的研究.pdf

1、目的: 觀察NMDA受體亞單位2B在正常和局灶性腦缺血再灌注大鼠腦室下區(qū)的表達(dá)情況及NR2B選擇性拮抗劑Ro25-6981對腦缺血后腦室下區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響。 方法: 健康成年雄性SD大鼠，體重250-280g，隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組和腦缺血再灌注組(又分為NS組和Ro25-6981組)。缺血再灌注組大鼠均采用線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型，即缺血90min再灌注3d、7d、14d、21d、28d。然后按如下方法

2、進(jìn)行： 1、用焦油紫染色觀察各組大鼠腦室下區(qū)(SVZ)細(xì)胞構(gòu)筑及病理改變； 2、用免疫組織化學(xué)單標(biāo)技術(shù)顯示各組大鼠SVZ區(qū)NR2B的表達(dá)情況：并用熒光免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)觀察SVZ區(qū)Nestin/NR2B陽性細(xì)胞的表達(dá)； 3、用5-溴脫氧尿核苷(BrdU，標(biāo)記增殖細(xì)胞)脈沖式標(biāo)記結(jié)合免疫組織化學(xué)單標(biāo)技術(shù)，觀察腦缺血再灌注各時間點SVZ區(qū)BrdU、Nestin(標(biāo)記神經(jīng)前體細(xì)胞)陽性細(xì)胞的表達(dá)變化；用BrdU累積式

3、標(biāo)記結(jié)合熒光免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)，觀察腦缺血28d后SVZ區(qū)BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞的表達(dá)變化。 結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD)，組間比較采用單因素方差分析，多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD)，實驗組之間比較采用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、焦油紫染色結(jié)果光鏡觀察可見正常大鼠SVZ區(qū)細(xì)胞密集，圓

4、形或橢圓形，核深染，沿胼胝體腹側(cè)向外側(cè)延伸。假手術(shù)組鏡下所見同正常組。腦缺血后各組SVZ區(qū)細(xì)胞形態(tài)雖無明顯改變，但其數(shù)目和分布范圍較正常組有所擴(kuò)大。 2、NR2B免疫組化染色結(jié)果各組大鼠SVZ區(qū)均可見NR2B陽性細(xì)胞，假手術(shù)組陽性細(xì)胞灰度值與正常組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MCAO-NS組大鼠缺血側(cè)NR2B灰度值在缺血后3d開始增加，7d達(dá)到高峰，21d恢復(fù)至正常水平；缺血對側(cè)變化趨勢同缺血側(cè)，但幅度較小，僅在缺血

5、再灌7d與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腹腔注射Ro25-6981后，NR2B的表達(dá)量明顯降低，缺血再灌后3d、7d、14d與相應(yīng)時間點的NS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示SVZ區(qū)存在NR2B與Nestin共存的陽性細(xì)胞。 3、BrdU免疫組化染色結(jié)果MCAO-NS組大鼠缺血側(cè)BrdU陽性細(xì)胞在腦缺血后3d明顯增加，7d達(dá)到高峰，28d仍高于正常水平；MCAO-Ro組與正常組比較僅在

6、缺血后7d出現(xiàn)一過性的增高。缺血再灌各時間點Ro25-6981組與相應(yīng)的NS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 4、Nestin免疫組化染色結(jié)果MCAO-NS組大鼠缺血側(cè)Nestin陽性細(xì)胞灰度值在腦缺血后3d開始增加，7～14d達(dá)到高峰，21d明顯降低，28d恢復(fù)正常；MCAO-Ro組與正常組比較僅在缺血后28d出現(xiàn)一過性的增高，其余時間點與正常組比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，缺血再灌注3d、7d、14d、

7、21dRo25-6981組與相應(yīng)的NS組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 5、熒光免疫組織化學(xué)雙標(biāo)結(jié)果：腦缺血28d后，MCAO-NS組大鼠缺血側(cè)在SVZ周圍的實質(zhì)內(nèi)可見BrdU/NeuN(標(biāo)記成熟神經(jīng)元)雙標(biāo)細(xì)胞，偶見BrdU/GFAP(標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞)雙標(biāo)細(xì)胞：給予Ro25-6981后，SVZ區(qū)未見BrdU/NeuN細(xì)胞表達(dá)，偶見BrdU/GFAP陽性細(xì)胞。 結(jié)論: 1、腦室下區(qū)神經(jīng)干/祖細(xì)胞上有N