抗α1-受體抗體介導(dǎo)免疫鏈接和炎癥在糖尿病鼠腎損害的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害著人們的身體健康及生活質(zhì)量，糖尿病腎病(diabetic nephropath，DN)是DM的主要微血管并發(fā)癥，是腎功能衰竭的主要原因之一。其主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracel lularMatrix，ECM)積聚和基底膜增厚。目前認(rèn)為，ECM的合成和降解受多種細(xì)胞因子（如TGF-β1、c-fos、炎癥因子等）和多條信號(hào)通路（如Smad和M

2、APK通路等）的影響，是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程。
　　 Ⅳ型膠原是ECM的主要成分，也是衡量ECM積聚的主要指標(biāo)。TGF-β超家族在DN腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用，TGF-β主要靠其下游的Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮作用，Smad2、Smad3是主要的信號(hào)傳導(dǎo)分子。c-fos是細(xì)胞核內(nèi)重要的原癌基因，介導(dǎo)許多與免疫反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄活化過(guò)程，并促進(jìn)炎癥的發(fā)生。另外，DN是一種炎癥性疾病，已得到諸多學(xué)者的認(rèn)可，其中

3、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）作為重要的炎癥介質(zhì)，也與DN的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。
　　 G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)是與GTP調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)的跨膜受體超分子家族，包括α1、β1、AT1受體等。大量報(bào)道顯示，腎損害與GPCR自身抗體有關(guān)，使用相應(yīng)的受體拮抗劑能

4、在一定程度起到腎臟保護(hù)作用，其中以高血壓腎損害與GPCR自身抗體之間的關(guān)系研究最多，DN腎損害與GPCR自身抗體之間的關(guān)系研究相對(duì)較少。
　　 多沙唑嗪為α1受體阻滯劑，能夠高度選擇性、不可逆的與α1受體結(jié)合，在臨床上廣泛用于高血壓病的治療。我們課題組已在前期的動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)，多沙唑嗪可與α1-受體自身抗體(autoantibodies againstα1-adrenergicreceptor，α1-AA)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合于α1-受

5、體上，阻斷由α1-AA注射入鼠體內(nèi)導(dǎo)致的TGF-β1的高表達(dá)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終阻斷腎基質(zhì)重構(gòu)。但其在DN中的作用機(jī)制目前還沒(méi)有完全闡明。
　　 本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠DN的模型，采用體內(nèi)注射α1-AA的方法對(duì)大鼠進(jìn)行介導(dǎo)，繼續(xù)深入研究α1-AA介導(dǎo)對(duì)DN大鼠腎組織Ⅳ型膠原、Smad2/3、c-fos蛋白表達(dá)及血清IL-6、ICAM-1水平的影響，及應(yīng)用多沙唑嗪干預(yù)的腎臟保護(hù)作用及機(jī)制，期望能為進(jìn)一步研究DN發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

6、r>　　 方法：
　　 第一章α1-AA介導(dǎo)對(duì)糖尿病鼠腎組織Ⅳ型膠原、Smad2/3、c-fos及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響動(dòng)物分為健康鼠空白對(duì)照組（N組）、DM鼠無(wú)α1-AA介導(dǎo)組（DM組）及DM鼠α1-AA介導(dǎo)組（DM+α1-AA組）。采用STZ注射法制備動(dòng)物模型。造模成功后:DM+α1-AA介導(dǎo)組在0、4、8、12、16周鼠尾靜脈一次性注射α1-AA，100μg/100g體重。觀察大鼠一般情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)放射免疫法測(cè)定24小

7、時(shí)尿蛋白(24 hoururine protein，24hUpro)、血清肌酐值(Serum creatinine，SCr)，免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中Ⅳ型膠原、Smad2/3、c-fos蛋白分布及表達(dá)情況，ELISA法測(cè)定血清α1-AA、IL-6、ICAM-1水平，并在電鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組腎組織近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及腎小球的改變。
　　 第二章α1-受體拮抗劑對(duì)糖尿病鼠腎組織Ⅳ型膠原、Smad2/3及c-fos表達(dá)的影響DM動(dòng)物模

8、型建立及α1-AA介導(dǎo)方法同第一章。造模成功后，動(dòng)物分為DM鼠無(wú)α1-AA介導(dǎo)組（單純DM組）、DM鼠α1-AA介導(dǎo)組（DM+α1-AA組）、DM鼠α1-AA介導(dǎo)+多沙唑嗪干預(yù)組（DM+α1-AA+多沙唑嗪組）及DM鼠無(wú)α1-AA介導(dǎo)多沙唑嗪干預(yù)組（DM+多沙唑嗪組），并設(shè)立健康鼠空白對(duì)照組（N組）;DM+α1-AA+多沙唑嗪干預(yù)組、DM鼠+多沙唑嗪組按0.36mg/kg給藥劑量、10ml/kg大鼠給藥容量灌胃給藥，1/d，連續(xù)16周。

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)放射免疫法測(cè)定24hUpro、SCr，免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中Ⅳ型膠原、Smad2/3、c-fos蛋白分布及表達(dá)情況，并在電鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組腎組織近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及腎小球的改變。
　　 第三章α1-受體拮抗劑對(duì)糖尿病鼠血清IL-6和ICAM-1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取血，ELISA法檢測(cè)血清IL-6、ICAM-1表達(dá)，余同第二章。
　　 結(jié)果：
　　 第一章α1-AA介導(dǎo)對(duì)糖尿病鼠腎組織Ⅳ型膠原、Sm

10、ad2/3、c-fos及相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響
　　 1、各組大鼠體重、FBG比較DM大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，體重顯著增加，注射STZ后體重開(kāi)始下降，DM+α1-AA組體重下降明顯，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DM+α1-AA組與DM組體重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后，DM大鼠FBG均達(dá)到16.7mmol/L以上，并且一直維持在一個(gè)較高水平，與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;DM+α1-AA組與DM組大鼠血糖無(wú)明顯差異。
　　 2、各組SC

11、r和24hUpro比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DM組和DM+α1-AA組大鼠的Scr和24hUpro較N組均顯著升高，DM+α1-AA組與DM組相比，上述指標(biāo)升高更明顯。
　　 3、各組電鏡下腎臟組織病理學(xué)改變電鏡下N組未見(jiàn)明顯異常，DM組可見(jiàn)輕度異常，DM+α1-AA組微觀結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。
　　 4、各組腎臟組織免疫組化結(jié)果N組腎組織無(wú)明顯染色;DM組與N組比較，可在腎小球及腎小管內(nèi)見(jiàn)大量的陽(yáng)性細(xì)胞，DM+α1-AA介導(dǎo)組大鼠腎組織

12、廣泛強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，顯著高于DM組。
　　 5、ELISA結(jié)果造模后大鼠血清IL-6及ICAM-1水平升高，DM+α1-AA組大鼠血清IL-6及ICAM-1水平著高于DM組。
　　 第二章α1-受體拮抗劑對(duì)糖尿病鼠腎組織Ⅳ型膠原、Smad2/3及c-fos表達(dá)的影響
　　 1、各組大鼠實(shí)驗(yàn)前、后體重的變化造模后，各組大鼠體重較實(shí)驗(yàn)前均有顯著下降;實(shí)驗(yàn)后，單純DM組、DM+α1-AA組較DM+α1-AA+多沙唑嗪組、D

13、M+多沙唑嗪組下降明顯，DM+α1-AA+多沙唑嗪組、DM+多沙唑嗪組比較，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、各組SCr和24hUpro比較DM大鼠Scr和24hUpro均顯著升高。DM+α1-AA組與DM+α1-AA+多沙唑嗪組比較，Scr和24hUpro較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單純DM組、DM+α1-AA+多沙唑嗪組、DM+多沙唑嗪組比較，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、各組電鏡下腎臟組織病理學(xué)改變N組大鼠腎臟超微

14、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。單純DM組足突融合，系膜基質(zhì)增多、腫脹，系膜區(qū)擴(kuò)大，可見(jiàn)高密度電子沉積物，基底膜局部增厚。DM+α1-AA介導(dǎo)組足細(xì)胞的損傷相對(duì)單純DM組更加嚴(yán)重，細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞器溶解，溶酶體增多，內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞器溶解，微絨毛腫脹，基底膜明顯增厚。多沙唑嗪干預(yù)后病變明顯減輕。DM+多沙唑嗪組也有系膜區(qū)擴(kuò)大，基底膜局部增厚等結(jié)構(gòu)改變。
　　 4、各組腎臟組織Ⅳ型膠原、Smad2/3及c-fos的表達(dá)結(jié)果N組腎組

15、織無(wú)明顯或僅有較弱陽(yáng)性表達(dá);單純DM組可在腎小球及腎小管內(nèi)見(jiàn)大量的陽(yáng)性細(xì)胞，DM+α1-AA介導(dǎo)組大鼠腎組織廣泛強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。DM+α1-AA+多沙唑嗪干預(yù)組、DM+多沙唑嗪干預(yù)組與單純DM組、DM+α1-AA介導(dǎo)組比較陽(yáng)性表達(dá)顯著改善;DM+α1-AA+多沙唑嗪干預(yù)組與DM+多沙唑嗪干預(yù)組比較，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三章α1-受體拮抗劑對(duì)糖尿病鼠血清IL-6和ICAM-1表達(dá)的影響
　　 1、各組大鼠24hUp

16、ro及KW/BW比較DM大鼠24hUpro及KW/BW均較N組顯著升高。DM+α1-AA組與DM+α1-AA+多沙唑嗪組比較，24hUpro及KW/BW較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單純DM組、DM+α1-AA+多沙唑嗪組、DM+多沙唑嗪組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、各組大鼠血清IL-6及ICAM-1含量比較造模后大鼠血清IL-6和ICAM-1水平升高，多沙唑嗪干預(yù)后出現(xiàn)不同程度的降低。DM+α1-AA組大鼠血清兩種炎癥介質(zhì)水

17、平，顯著高于單純DM組，DM+α1-AA組與DM+α1-AA+多沙唑嗪比較，后者IL-6下降明顯，DM+α1-AA+多沙唑嗪、DM+多沙唑嗪與單純DM組比較，差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ICAM-1結(jié)果與IL-6結(jié)果相同，單純DM與DM+α1-AA組比較、DM+α1-AA組比較與DM+α1-AA+多沙唑嗪比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、各組24hUpro、KW/BW分別與血清IL-6及ICAM-1含量進(jìn)行相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示:

18、24hUpro與IL-6、ICAM-1水平呈正相關(guān);KW/BW與IL-6、ICAM-1水平呈正相關(guān)。
　　 4、各組電鏡下腎臟組織病理學(xué)改變同第二章。
　　 結(jié)論：
　　 1、DN既是一種免疫反應(yīng)，又是一種炎癥反應(yīng)，兩者密切聯(lián)系并且正相關(guān)。
　　 2、注射入鼠體內(nèi)的α1-AA可能通過(guò)MAPK、TGF-β1/smad通路及GPCR之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)Ⅳ型膠原、Smad2/3和c-fos的表達(dá)增多，最終導(dǎo)致腎