TRAIL、DR5及NF-κB p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕中的表達及其意義研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景: 瘢痕是各種創(chuàng)傷組織修復愈合的必然結(jié)果。它主要發(fā)生在創(chuàng)傷、感染、手術(shù)和燒傷等創(chuàng)面中。增生性瘢痕(hypertrophicscar,HS)是最常見的病理性瘢痕(PathologicScar),其是以成纖維細胞的過度增生和細胞外基質(zhì)成分的過度聚集為主要特征,臨床上其雖然僅局限在原傷口范圍內(nèi)生長,但其發(fā)病機制至今尚不確切。其臨床表現(xiàn)為局部疼痛、瘙癢、突出于皮膚表面的增生腫塊,并伴有不同程度的功能障礙,危害人們的身心健康,在預(yù)

2、防及治療上尚無特效方法,是目前整形外科研究的熱點和難點問題之一。 細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象,是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。細胞凋亡(apoptosis),又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD),是有別于細胞壞死而受基因控制的一種主動性細胞自殺過程。腫瘤壞死因子凋亡配體[Tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis-inducing

3、 ligand,TRAIL]廣泛地存在于人體各個組織和器官,能定向地導致異常細胞的凋亡,而不會影響正常細胞的生長分化。在增生性瘢痕中TRAIL的死亡受體5(DeathReceptor 5,DR5)起著重要的促凋亡作用[1]。越來越多的研究表明許多疾病的發(fā)生、發(fā)展都與TRAIL的凋亡抑制有關(guān),以TRAIL作為靶點治療或緩解疾病已經(jīng)成為研究熱點,并已應(yīng)用于臨床實驗中。 核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是

4、一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子,對細胞內(nèi)許多基因的表達起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用,參與細胞的生長、發(fā)育、凋亡等多種生理功能,并在細胞惡性轉(zhuǎn)化、纖維化等方面起重要作用。越來越多的研究表明許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與NF-κB的過度活化有關(guān)。NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路也貫穿于創(chuàng)傷修復與愈合的整個生物學過程。研究表明,NF-κBp65是NF-κB信號傳導通路的關(guān)鍵基因。 目前,有關(guān)TRAIL及其DR5和NF-κBp65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性

5、瘢痕中表達狀況如何、它們之間的聯(lián)系如何等問題國內(nèi)外尚未見報道。本研究擬以人難愈合創(chuàng)面肉芽組織、不同時間范圍階段的增生性瘢痕為研究對象,以正常皮膚為對照,采用免疫組化、RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測TRAIL及其死亡受體DR5和NF-κB在難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕各階段中的表達,并探討其之間的聯(lián)系,以進一步探討瘢痕增生的機理,為臨床治療增生性瘢痕提供新的研究方向和思路。 目的: 本研究擬觀察TRAIL信

6、號傳導通路中凋亡因子TRAIL及其凋亡受體DR5和NF-κB信號傳導通路關(guān)鍵基因p65在人難愈合創(chuàng)面肉芽組織、不同時間階段的增生性瘢痕以及正常皮膚標本的表達水平是否存在差異及TRAIL、DR5和NF-κBp65之間的聯(lián)系。 方法: 收集臨床標本40例為實驗組,其中難愈性創(chuàng)面難愈合創(chuàng)面肉芽組織(A組)、半年內(nèi)增生性瘢痕(B組)、半年至一年增生性瘢痕(C組)、一年以上增生性瘢痕(D組)組織各10例,收集正常皮膚組織標本8例為

7、對照組(E組)。采用組織免疫化學方法分析各標本中TRAIL、NF-κBp65表達;提取RNA以及核蛋白,實時熒光定量RT-PCR檢測組織中TRAIL、DR5及NF-κBp65mRNA表達水平:利用Westernblot技術(shù)檢測TRAIL以及NF-κBp65的蛋白表達水平。 結(jié)果: 1.病理切片HE染色各組組織均為相應(yīng)的病理表現(xiàn)。A組中可見大量內(nèi)皮細胞和毛細血管,以及許多新生的圓形纖維母細胞,膠原纖維形成少,有炎性細胞浸潤

8、。B組到D組中纖維母細胞逐漸減少,形態(tài)由扁圓形逐漸變?yōu)榧氶L,炎性細胞和毛細血管逐漸減少至消失,皮下膠原纖維由粗大、紊亂逐漸變細、排列逐漸變規(guī)則,表皮較正常皮膚薄,無腳突和皮膚附屬器。E組表皮層次清楚,角化層角化明顯,皮膚附屬器豐富,膠原纖維束排列規(guī)則,少而疏松、細胞較少。 2.免疫組化SP法染色TRAIL在A組、B組成纖維細胞細胞漿中表達強陽性,C組、D組陽性表達逐漸減弱,接近E組;A組和B組表達明顯強于C組、D組和E組;NF-

9、κBp65主要表達部位為基底細胞和成纖維細胞的細胞漿和細胞核內(nèi),A組內(nèi)表達與E組接近,在增生性瘢痕各階段(B、C、D組)中表達陽性,尤其是在B組中皮膚基底細胞層細胞陽性表達尤為明顯。 3.RT-PCR檢測TRAILmRNA表達水平在A組和B組呈較高水平,明顯均高于其它各組(p<0.05),而A組與B組之間差異無顯著的統(tǒng)計學意義(p>0.05),C組、D組與E組各組間比較,其差異也均無顯著的統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 D

10、R5mRNA表達水平在A組中最高,明顯高于各組(p<0.05),B、C、D組表達水平均低于E組,其差異均有顯著的統(tǒng)計學意義(p<0.05),但B、C、D組之間比較,其差異均無顯著的統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 NF-κBp65mRNA表達水平各組間比較,其差異均無顯著的統(tǒng)計學意義(p>0.05)。但從各組均數(shù)來看,E組和A組處于較低水平(A組為0.38,E組為0.30),B、C、D組處于較高水平(B組為0.44,C組為0.46,

11、D組為0.47),數(shù)值相近,并且有高于E組和A組的趨勢。 在TRAIL與DR5線性相關(guān)分析中,Pearson相關(guān)系數(shù)為0.291,P=0.045<0.05,說明TRAIL與DR5存在正相關(guān)。 在NF-κBp65與TRAIL線性相關(guān)分析中,NF-κBp65與TRAIL的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.371,P=0.009<0.05,說明NF-κBp65與TRAIL存在正相關(guān)。 在NF-κBp65與DR5線性相關(guān)分析中

12、,Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.088,P=0.554>0.05,說明NF-κBp65與DR5相關(guān)性無顯著的統(tǒng)計學意義。 4.Westernblot檢測TRAIL在A組和B組中蛋白表達水平較高,在C組、D組、E組蛋白表達水平基本接近,經(jīng)統(tǒng)計學處理,A組和B組蛋白表達水平明顯高于其它各組(p<0.05),而A組與B組之間差異無顯著的統(tǒng)計學意義(p>0.05)。 NF-κBp65在A組和E組中蛋白表達水平差異沒有顯著的統(tǒng)計學

13、意義(p>0.05),B組、C組、D組的蛋白表達水平明顯要高于A組和E組(p<0.05)。 結(jié)論: 1.在難愈合創(chuàng)面肉芽組織中TRAIL和死亡受體DR5表達水平明顯增高,NF-κBp65表達水平較低,表明難愈合創(chuàng)面肉芽組織中細胞凋亡增強,抗凋亡水平受到抑制,組織難以愈合。 2.在增生性瘢痕早期(半年內(nèi))中,TRAIL的表達仍然較高,但其死亡受體DR5的凋亡水平明顯低于正常,NF-κBp65的表達明顯增強,表明在增

14、生性瘢痕早期瘢痕組織凋亡作用降低,抗凋亡作用明顯增強,瘢痕組織表現(xiàn)出明顯的增生作用。NF-κBp65皮膚基底細胞層細胞陽性表達尤為明顯,表明NF-κBp65可能在增生性瘢痕增生中發(fā)揮著重要作用,對增生性瘢痕凋亡有著強有力的抑制作用,促進了增生性瘢痕增生。 3.在增生性瘢痕后期(半年-1年),TRAIL及其死亡受體DR5的表達均處于較低水平,NF-κBp65的表達仍高于正常皮膚,表明在增生性瘢痕后期細胞凋亡水平較低,抗凋亡水平較高

15、,仍有組織增生。 4.在增生性瘢痕成熟期(1年后),TRAIL和NF-κBp65表達水平接近正常皮膚。瘢痕組織凋亡作用增強,增生減弱,變得平坦和消退。 5.NF-κBp65與TRAIL存在正相關(guān),表明了TRAIL與NF-κBp65表達水平變化趨勢是同向的,在一定程度上反映了TRAIL表達與NF-κBp65表達相互影響和作用。TRAIL與DR5存在正相關(guān),表明TRAIL與其受體DR5表達水平的變化趨勢是同向的,在一定程度上

16、反映了組織細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性。 意義: 本研究率先檢測了TRAIL、死亡受體DR5和NF-κBp65在難愈合創(chuàng)面肉芽組織及增生性瘢痕中不同增生階段的表達,提示了TRAIL凋亡途徑和NF-κBp65凋亡調(diào)控極有可能參與難愈合創(chuàng)面肉芽組織和增生性瘢痕的異常凋亡過程,對進一步認識難愈合創(chuàng)面肉芽組織的修復和瘢痕增生的機制及其防治具有一定意義,為我們在臨床上開展難愈性肉芽創(chuàng)面治療和瘢痕增生防治提供新的研究方向和思路。

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