生物樣品中C60含量的熒光分析研究.pdf

1、1985年Kroto等人在研究激光蒸發(fā)石墨的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了C60,由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而具有特殊的理化性質(zhì)。目前,C60及其衍生物已廣泛用于抑制蛋白和酶的活性、切割DNA和光動(dòng)力學(xué)治療、清除自由基和作為靶向制劑的載體等,在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。然而,對(duì)于C60進(jìn)入生物體內(nèi)行為的研究還為數(shù)不多,而且C60多數(shù)是以納米顆粒存在于分散液中,進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)在不同的組織器官中發(fā)生沉積,對(duì)生物體產(chǎn)生一定的毒害損傷。因此需要系統(tǒng)研究C60在生物體內(nèi)

2、的分布、代謝以及定量情況,而對(duì)生物樣品中C60的含量測(cè)定是研究其在體內(nèi)行為的一個(gè)重要方面,本文從以下幾個(gè)部分來(lái)研究C60的含量測(cè)定及與蛋白相互作用。
　　 ⑴肝癌細(xì)胞內(nèi)C60含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用安全濃度范圍內(nèi)的泊洛沙姆(10％polo)分散C60,得到穩(wěn)定的C60分散液。對(duì)C60分散液熒光性質(zhì)進(jìn)行考察,得到最佳的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別在220 nm和371 nm處。實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中含有胎牛血清,而胎牛血清在波長(zhǎng)300-50

3、0 nm處有熒光發(fā)射,對(duì)C60分散液的含量測(cè)定產(chǎn)生干擾。另外,消化細(xì)胞時(shí)所用的胰酶主要由胰蛋白酶、胰淀粉酶與胰脂肪酶組成,同樣在C60分散液的熒光測(cè)定范圍內(nèi)有熒光發(fā)射,影響測(cè)定。因此需要對(duì)樣品進(jìn)行處理以排除這些干擾。實(shí)驗(yàn)通過(guò)以PBS代替培養(yǎng)基吹打細(xì)胞,多次離心去除胰酶的干擾;采用碳超破碎細(xì)胞后離心,去除細(xì)胞內(nèi)源物質(zhì)的干擾,使得該熒光光譜法得到較好的測(cè)定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C60在1.28-46.03 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,肝癌

4、細(xì)胞裂解液中C60平均回收率為86.5%,RSD為10.8%。
　　 ⑵C60與牛血清白蛋白相互作用研究。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的方法處理血樣后,空白血樣在熒光分光光度計(jì)上掃描得到的熒光強(qiáng)度高于含C60的血樣的熒光強(qiáng)度,使用陽(yáng)離子表面活性劑CTAB處理血樣也出現(xiàn)了同樣的情況。因此以牛血清白蛋白為模型,通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步計(jì)算C60與牛血清白蛋白的淬滅及結(jié)合常數(shù)可以得出C60與牛血清白蛋白之間產(chǎn)生了一定的相互作用,并且影響了牛血清白

5、蛋白的結(jié)構(gòu)。初步推測(cè)是由于牛血清白蛋白構(gòu)象的改變致使其水溶性降低,在離心的過(guò)程中將C60一同離心到沉淀中,而使上層清液中存在的C60含量減少?gòu)亩鴮?dǎo)致熒光分光光度計(jì)無(wú)法檢測(cè)出C60的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C60水溶液對(duì)牛血清白蛋白有熒光淬滅作用,兩者結(jié)合常數(shù)在104 L/mol數(shù)量級(jí)以上,結(jié)合位點(diǎn)接近于色氨酸殘基。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)推斷C60水溶液與牛血清白蛋白有可能是通過(guò)疏水作用力相互結(jié)合。實(shí)驗(yàn)中采用溶劑置換(甲苯與水)的方法制備C60水溶液

6、,加入表面活性劑對(duì)C60的分散及熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯的增強(qiáng)效果。同時(shí)考察了C60水溶液的濃度確定方法,使用NaCl破壞C60水溶液穩(wěn)定性,甲苯提取率達(dá)到98%以上,可以認(rèn)為此方法能夠提取完全。
　　 ⑶血清中C60含量測(cè)定。曾有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定血樣中C60的含量,測(cè)定的準(zhǔn)確度較高,但是由于血樣處理過(guò)程較為復(fù)雜而且使用甲苯作為流動(dòng)相,對(duì)操作者和儀器均有較大損害,同時(shí)樣品損失較大,測(cè)定結(jié)果不能真實(shí)反映體內(nèi)C60含量。本實(shí)驗(yàn)采用