DDFA對重癥胰腺炎大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景： 重癥急性胰腺炎(SAP)常并發(fā)多器官功能障礙(MODS)，其胰外器官損傷中腎功能障礙(胰性腎病)發(fā)生率約14％-43％，僅次于肺功能障礙，發(fā)展至急性腎功能衰竭(ARF)后死亡率高達(dá)71％-84％。目前對其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，研究表明：與SAP腎臟損傷有關(guān)的因素包括腎臟血流動力學(xué)的異常、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的作用、腫瘤壞死因子(TNFα)、磷脂酶A2(PLA2)、血小板活化因子(PAF)、內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO

2、)、前列環(huán)素(pGI2)和血栓素A2(TXA2)、急性腹腔間隔室綜合癥、細(xì)胞凋亡等。其中細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在外科多種疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中已受到越來越多的關(guān)注，在許多疾病繼發(fā)的腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制中也起著十分重要的作用。動物實(shí)驗(yàn)表明：在糖尿病大鼠、心力衰竭大鼠、阿霉素腎病大鼠及內(nèi)毒素中毒大鼠等的腎臟組織中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡明顯增加，促凋亡基因表達(dá)升高，而抑制凋亡的基因表達(dá)下降，凋亡細(xì)胞數(shù)往往與腎功能惡化程度成正比

3、，表明繼發(fā)性腎臟損傷發(fā)展過程中細(xì)胞數(shù)目的減少和腎功能的下降，至少部分是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制引起的，而且細(xì)胞凋亡是造成腎功能進(jìn)一步惡化的重要因素之一。細(xì)胞凋亡是受凋亡相關(guān)基因調(diào)控的，一些對繼發(fā)性腎臟損傷有治療作用的藥物正是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)以減少腎臟細(xì)胞的凋亡，從而起到保護(hù)和改善腎功能的作用。雖然誘發(fā)凋亡的刺激因素各異，但其通過使腎小管上皮細(xì)胞丟失而導(dǎo)致腎功能受損，在各種形式的繼發(fā)性腎損傷中均具有重要意義。胰性腎病也是一種繼發(fā)性腎臟損

4、傷，因此可以預(yù)見細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因在胰性腎病發(fā)病機(jī)制中也起著相當(dāng)重要的作用，探討SAP腎臟損傷的分子發(fā)病機(jī)制，通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因進(jìn)行及時干預(yù)，以減少腎臟細(xì)胞凋亡，應(yīng)當(dāng)有助于胰性腎病的治療，并將為臨床治療方法上的創(chuàng)新提供理論支持和指明方向，無疑具有重大意義。 DDFA已經(jīng)臨床證實(shí)對SAP有明顯的治療效果，但其治療SAP的機(jī)理如何，是否通過調(diào)控細(xì)胞凋亡對SAP起治療作用，對機(jī)體各重要臟器細(xì)胞凋亡是否有影響，在什么時間、用什么方

5、式、什么劑量應(yīng)用影響最大、效果最好，DDFA各藥物間在影響細(xì)胞凋亡方面是否有協(xié)同或拮抗作用，進(jìn)一步調(diào)整該方案、調(diào)整藥物間的劑量組合是否有更好的效果，等等，這些問題都需要進(jìn)行驗(yàn)證和探索。本課題擬通過動物實(shí)驗(yàn)解決這些問題中的一部分，以利于臨床DDFA方案的進(jìn)一步完善，并為此方案臨床推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的： 本課題旨在：1、研究正常大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因的表達(dá)情況。2、研究大鼠發(fā)生重癥胰腺炎(SAP)后

6、腎臟細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達(dá)的變化，探討細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達(dá)在SAP大鼠腎臟損傷中的作用，從而明確SAP腎臟損傷的部分機(jī)制。3、研究SAP大鼠應(yīng)用DDFA治療后腎臟細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2基因表達(dá)的變化情況，明確DDFA對SAP大鼠腎臟損傷的治療作用，探討DDFA對SAP腎臟損傷的治療機(jī)制，為DDFA方案的臨床應(yīng)用及推廣提供理論依據(jù)。 材料和方法： 1、45只大鼠隨機(jī)分成三組：SO組(假手

7、術(shù)組)15只；SAP組15只；DDFA治療組15只。每組再分為6h、12h、18h三個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)分配5只大鼠。 2、大鼠SAP模型采用5％牛磺膽酸鈉逆行膽胰管注射法建立；SO組僅行胰膽管穿刺操作，不注射藥物；DDFA組在SAP模型誘發(fā)后，經(jīng)頸靜脈注射DDFA。 3、建模后6h、12h、18h時分別處死各組各時間點(diǎn)大鼠，肉眼觀察腹腔臟器改變情況，HE染色觀察腎臟組織病理變化，全自動生化分析儀測定血Cr、BUN，TU

8、NEL法測定腎臟細(xì)胞凋亡，SABC免疫組化染色法測定腎臟Bax、Bcl-2基因表達(dá)。 4、采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫，均數(shù)比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，組間兩兩比較用DunnettT3法，細(xì)胞凋亡與腎功能損害的相關(guān)性用相關(guān)分析。P＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1、SO組腎組織未見病理損害，血Cr、BUN正常，偶見腎臟細(xì)胞凋亡，腎小球和腎小管區(qū)Bax均有較弱表達(dá)，Bcl-2在腎小管區(qū)有一定

9、的表達(dá)。 2、SAP組腎組織病理損害明顯，血Cr、BUN較SO組升高。腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)各時間點(diǎn)均顯著高于SO組(均P＜0.01)，腎臟Bax蛋白表達(dá)水平各時間點(diǎn)也顯著高于SO組(均P＜0.01)，并且隨病程延長而逐漸增高。SAP組各時間點(diǎn)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平也高于SO組(差異性分別P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05)。Bcl-2/Bax比值則低于SO組，并且隨著時間延長逐漸下降。 3、DDFA組較SAP組腎組織

10、病理損害減輕，血Cr、BUN明顯下降。腎臟各時間點(diǎn)細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于SAP組(差異性分別為P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05)，但仍有隨病程延長而逐漸增高的趨勢。腎臟各時間點(diǎn)Bax蛋白表達(dá)水平也明顯低于SAP組(差異性分別為P＜0.05；P＜0.05；P＜0.05)。Bcl-2蛋白的表達(dá)水平則高于SAP組(差異性分別為P＜0.05；P＜0.05；P＜0.05)。Bcl-2/Bax比值也高于SAP組。 結(jié)論： 1、

11、SAP發(fā)生后，腎臟病理形態(tài)及腎功能均受到明顯損害，凋亡細(xì)胞明顯增多，AI升高，并隨著時間延長而逐漸增高，腎小管凋亡現(xiàn)象較。腎小球嚴(yán)重，AI的變化與腎功的指標(biāo)Cr、BUN呈明顯的正相關(guān)。說明SAP腎臟損傷至少部分是通過細(xì)胞凋亡機(jī)制引起的，而且細(xì)胞凋亡尤其是腎小管細(xì)胞凋亡是造成腎功能進(jìn)一步惡化的重要因素之一。 2、應(yīng)用DDFA治療后，腎臟病理形態(tài)改善，腎功能損害減輕，凋亡細(xì)胞減少，AI明顯下降，但在一定時間內(nèi)，腎臟損害程度仍有隨時間

12、延長而加重的趨勢。說明DDFA對SAP腎臟損傷有明顯的治療作用，在SAP早期給予DDFA治療對減輕腎臟損害程度、改善預(yù)后是有益的，但單次用藥并不能完全防止SAP腎功損害，應(yīng)考慮繼續(xù)定期追加用藥。 3、正常腎臟腎小球和腎小管區(qū)Bax均有較弱表達(dá)，Bcl-2在腎小管區(qū)有一定的表達(dá)，總體上兩類基因處于相對平衡狀態(tài)；SAP時Bax和Bcl-2的表達(dá)均增強(qiáng)，Bax增強(qiáng)較明顯，并且隨著病程延長而逐漸增高，Bcl-2增幅相對較小，并且12h后