腦外傷后自噬-凋亡-質(zhì)膜修復(fù)的作用及相互調(diào)節(jié)機(jī)制的初步研究.pdf

1、顱腦損傷在法醫(yī)暴力性死亡案例中占首要位置，而腦外傷（traumatic braininjury，TBI）是顱腦損傷中最重要的損傷。在現(xiàn)代社會(huì)里，腦外傷發(fā)生和死亡率在青年人群中較高，也是在日常生活中入院治療的主要原因之一。腦損害的相關(guān)研究一直是臨床醫(yī)學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容，同時(shí)也是法醫(yī)學(xué)研究工作的重要內(nèi)容之一。過(guò)去的法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域?qū)Ｗ⒂谀X損傷的不良后果及與外力的作用機(jī)制相關(guān)性研究。因此，研究腦外傷后細(xì)胞損傷發(fā)生的機(jī)制，對(duì)醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)

2、均具有重要意義。腦外傷引起的神經(jīng)元機(jī)械性損害能引起一系列的反應(yīng)，如線粒體與溶酶體膜完整性損害、腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞死亡，以至影響腦的運(yùn)動(dòng)與學(xué)習(xí)記憶功能。腦外傷后細(xì)胞死亡機(jī)制已被深入研究。最近，有少量的文獻(xiàn)報(bào)道腦外傷后細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)。
　　自噬是一個(gè)過(guò)程，即:亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)的形態(tài)學(xué)改變，并通過(guò)溶酶體介導(dǎo)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過(guò)程，主要包括4個(gè)環(huán)節(jié):底物誘導(dǎo)自噬前體(proautophagosome，PAS)的形成、自噬體(auto

3、phagosome)形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內(nèi)容物被降解。一個(gè)突破性的研究表明凋亡抑制分子Bcl-2可以通過(guò)與自噬的標(biāo)記物之一Beclin-1相互作用，進(jìn)而對(duì)自噬發(fā)揮作用。自噬激活過(guò)程，往往與凋亡共存或同時(shí)發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)在腦外傷后24h神經(jīng)元中微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3(LC3)的表達(dá)明顯增強(qiáng)。然而，卻未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道自噬在腦外傷引起的細(xì)胞死亡和創(chuàng)傷性腦損害中的作用?；谝郧暗难芯?，我們提出了自噬機(jī)制參與了腦外傷引起腦損害的假

4、設(shè)。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，本課題的第一部分采用了自噬的特異性抑制劑，在小鼠體內(nèi)腦外傷模型中，研究了自噬在腦外傷引起的細(xì)胞死亡及腦損害中發(fā)揮的作用及機(jī)制，并探討了自噬與凋亡的相互關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，在第二部分我們研究了腦外傷后自噬激活的調(diào)節(jié)機(jī)制及凋亡信號(hào)通路之間的關(guān)系。
　　有研究報(bào)道p53與它的靶基因（PUMA、損害相關(guān)自噬調(diào)節(jié)因子DRAM）參與了自噬與凋亡過(guò)程。在體外興奮性中毒模型中，谷氨酸受體的過(guò)度刺激能誘發(fā)核因子-kappaB(N

5、F-κ B)依賴(lài)性的p53表達(dá)。并且NF-κ B/p53途徑通過(guò)凋亡與自噬的機(jī)制，參與了神經(jīng)毒性神經(jīng)元死亡。然而，很少有研究報(bào)道NF-κ B/p53在小鼠腦外傷模型中的作用。在此，我們研究了NF-κ B/p53途徑在腦外傷后自噬與凋亡激活中發(fā)揮的可能作用。
　　細(xì)胞質(zhì)膜完整性的喪失包括膜的起泡和通透性的改變，被認(rèn)為是引起腦外傷后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的主要因素，可以引起離子平衡失調(diào)與多種細(xì)胞途徑的激活。泊洛沙姆188（Poloxamer

6、188，P188）是一種非離子型、無(wú)毒的兩性分子聚合物(分子量約為8400)，包括中心疏水分子與兩側(cè)圍繞的兩條聚氧乙烯親水鏈。P188作為一種表面活性劑有多種臨床運(yùn)用價(jià)值，它被發(fā)現(xiàn)能修復(fù)受損的細(xì)胞膜。在小鼠皮質(zhì)損傷模型中，P188這種公認(rèn)的膜修復(fù)劑也顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞膜有很好的修復(fù)效果。而在皮質(zhì)與海馬神經(jīng)元培養(yǎng)中，P188具有保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性中毒或氧化應(yīng)激相關(guān)的壞死，并通過(guò)進(jìn)入膜內(nèi)參與抑制膜的過(guò)氧化反應(yīng)起到免受電穿孔的作用。然而，P188

7、對(duì)腦外傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不十分清楚，本研究中我們通過(guò)建立原代神經(jīng)元損傷模型，在TBI后繼發(fā)性損害（如線粒體與溶酶體膜通透性改變）方面探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　第一部分自噬對(duì)腦外傷引起的質(zhì)膜完整性破壞、腦缺損體積和神經(jīng)功能的影響
　　背景: 之前的研究表明腦外傷后自噬被激活，并增加LC3在神經(jīng)元中的表達(dá)。然而，自噬在腦外傷的作用機(jī)制還不是很明了。本部分研究的主要目的是探討自噬在腦外傷后神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用和對(duì)神經(jīng)功能的影響

8、。
　　方法: 我們使用改良的自由落體法建立小鼠腦外傷模型。在建模前10min，通過(guò)單側(cè)側(cè)腦室分別注射自噬的特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）與布雷菲德菌素(BFA)。我們首先使用透射電鏡進(jìn)行觀察，測(cè)定了腦外傷后自噬活性的改變情況。接著我們采用real-time PCR檢測(cè)LC3的mRNA水平，并通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)LC3Ⅱ與p62蛋白表達(dá)水平，它們均能用來(lái)評(píng)估自噬的表達(dá)水平。通過(guò)熒光雙標(biāo)LC3與碘化丙啶(PI)，觀測(cè)LC3在受

9、損細(xì)胞中的表達(dá)情況。PI標(biāo)記用來(lái)鑒別受損的細(xì)胞，并計(jì)數(shù)PI陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。為了進(jìn)一步探討PI陽(yáng)性細(xì)胞能否代表細(xì)胞的永久性丟失，我們?cè)谀X外傷后第七天還檢測(cè)了損傷后腦組織累積缺損的體積。最后，為進(jìn)一步研究3-MA抑制自噬是否與神經(jīng)功能改善有關(guān)，我們還做了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)和水迷宮實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果: ①電鏡檢測(cè)結(jié)果:與假手術(shù)組相比，腦外傷后1h至24h，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)主要變化為自噬體(APs)與自噬溶酶體(ALs)的數(shù)量明顯增

10、多。并在腦外傷后48h，可以看到細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)有明顯的核裂解現(xiàn)象發(fā)生。②LC3的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:從腦外傷后1h至48h，LC3 mRNA與蛋白水平均明顯上調(diào)，而在腦外傷后6h與24h，3-MA預(yù)防性給藥后能明顯下調(diào)受損皮質(zhì)中LC3 mRNA與LC3-Ⅱ蛋白水平。③p62的蛋白表達(dá)結(jié)果:與假手術(shù)組相比，腦外傷后6h與24h，p62在損傷側(cè)的蛋白表達(dá)明顯減少。而與腦外傷Saline組相比，3-MA與BFA預(yù)防性給藥后均能維持p62的蛋白表

11、達(dá)水平。④LC3免疫熒光檢測(cè)結(jié)果:在腦外傷后24h，LC3的免疫熒光反應(yīng)性增強(qiáng)，LC3的染色模式發(fā)生改變，即具有點(diǎn)狀的染色模式增多，而且LC3陽(yáng)性細(xì)胞與損傷中心的PI陽(yáng)性細(xì)胞共表達(dá)數(shù)量增多。增加的點(diǎn)狀LC3-Ⅱ與PI核染的細(xì)胞數(shù)被3-MA局部抑制。⑤PI細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果:與假手術(shù)組相比，PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在腦外傷后12h至72h顯著性增加，并在48h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰。分別與腦外傷后24h與48h的生理鹽水組相比，3-MA與BFA預(yù)防性給藥均能明

12、顯較少PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。⑥腦缺損體積檢測(cè):腦外傷也能引起腦組織的永久性丟失。與腦外傷生理鹽水組相比，3-MA與BFA給藥后均能明顯減輕腦外傷引起的體積缺損。⑦運(yùn)動(dòng)功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果:在腦外傷后1-4天，腦外傷引起小鼠的運(yùn)動(dòng)評(píng)分明顯降低(P＜0.01)，在第5天恢復(fù)到本底水平。在腦外傷后1-3天，3-MA給藥后能明顯加快運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(P＜0.05)。（⑧水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果:等各組之間的運(yùn)動(dòng)功能無(wú)明顯差異時(shí)，可繼續(xù)在11-20天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。與

13、11-18天的假手術(shù)組相比，腦外傷后小鼠找到隱蔽平臺(tái)的潛伏期均延長(zhǎng)(P＜0.05)。與腦外傷Vehicle組相比，外傷后14-17天3-MA給藥組的小鼠尋找潛伏期的時(shí)間明顯縮短(P＜0.05)。為了排除視力的影響，在實(shí)驗(yàn)的19與20天暴露出平臺(tái)，所有小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期均明顯縮短，但差別不大(P＞0.05)。最后，與假手術(shù)組相比，腦外傷3-MA處理的小鼠每天學(xué)習(xí)的程度更接近假手術(shù)小鼠，而腦外傷Vehicle組的小鼠每天學(xué)習(xí)的程度卻明顯下

14、降(P＜0.05)。3-MA抑制自噬能減輕行為學(xué)功能障礙，包括運(yùn)動(dòng)功能和記憶功能。
　　結(jié)論: 腦外傷后腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)、凋亡被激活。腦外傷引起的自噬激活可被自噬的抑制劑3-MA與BFA所抑制，表明細(xì)胞自噬參與了腦損害過(guò)程。增加的點(diǎn)狀LC3-Ⅱ與PI核染的細(xì)胞數(shù)被3-MA局部抑制，表明自噬與細(xì)胞死亡可能存在某種關(guān)聯(lián)，自噬可能參與了腦外傷引起的神經(jīng)元死亡。此外，3-MA與BFA均能減輕腦外傷引起的細(xì)胞死亡與體積缺損。自噬抑制

15、劑的這些保護(hù)作用可能與抑制腦外傷引起LC3表達(dá)上調(diào)，與p62蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。總之，以上數(shù)據(jù)表明，自噬途徑參與了腦外傷后病理生理學(xué)反應(yīng)，抑制自噬途徑也許能幫助減輕創(chuàng)傷性外傷性腦損害和功能障礙。
　　第二部分腦外傷后自噬激活的調(diào)節(jié)機(jī)制及與凋亡信號(hào)通路之間關(guān)系的研究
　　背景: 第一部分的研究結(jié)果顯示自噬參與了腦外傷后的病理生理變化過(guò)程。之前有文獻(xiàn)報(bào)道p53與它的靶基因（PUMA、損害相關(guān)自噬調(diào)節(jié)因子DRAM）參與了自噬與凋亡

16、過(guò)程。在體外興奮性中毒模型中，谷氨酸受體的過(guò)度刺激能誘發(fā)核因子-kappa B(NF-κ B)依賴(lài)性的p53表達(dá)。并且NF-κ B/p53途徑通過(guò)凋亡與自噬的機(jī)制，參與了神經(jīng)毒性神經(jīng)元死亡。然而，很少有研究報(bào)道NF-κ B/p53在小鼠腦外傷模型中的作用。本部分的主要研究目的是探討NF-κ B/p53途徑在腦外傷后自噬與凋亡激活中發(fā)揮的可能作用。
　　方法: 我們使用改良的自由落體法建立小鼠腦外傷模型。在建模前10min，通過(guò)單側(cè)

17、側(cè)腦室分別注射自噬的抑制劑3-MA、NF-κB抑制劑SN50、與p53抑制劑Pifithrin-alpha(PFT-α)。采用實(shí)時(shí)PCR與免疫印跡法，檢測(cè)了腦外傷后p53和它的靶基因PUMA、DRAM的時(shí)程改變，以及3-MA對(duì)它們的影響。同時(shí)為了觀察NF-κ B依賴(lài)性的p53-DRAM信號(hào)通路是否參與了TBI誘導(dǎo)的神經(jīng)元自噬與凋亡，我們還研究了SN50與PFT-α對(duì)腦外傷后p53和DRAM的作用。此外，SN50與PFT-α在腦外傷中的神

18、經(jīng)保護(hù)作用可通過(guò)檢測(cè)DNA條帶斷裂和缺損體積情況來(lái)完成。
　　結(jié)果: 從腦外傷后1h至24h，外傷能引起p53，PUMA和DRAM表達(dá)的明顯上調(diào)，并具有一定的時(shí)程變化規(guī)律。在腦外傷后6h與24h，3-MA均能明顯逆轉(zhuǎn)上述蛋白的上調(diào)(P＜0.05)。在腦外傷后24h，SN50與PFT-α均能逆轉(zhuǎn)p53、PUMA表達(dá)的上調(diào)。腦外傷可引起DNA片段的斷裂，并導(dǎo)致腦組織的永久性丟失(P＜0.05)，但與生理鹽水組相比，SN50和PFT-α

19、均能明顯減少腦外傷引起的DNA片段斷裂與體積的缺損(P＜0.05)。
　　結(jié)論: 以上結(jié)果表明腦外傷可引起NF-κB依賴(lài)性的p53的表達(dá)，NF-κB/p53途徑可通過(guò)自噬和凋亡機(jī)制參與腦外傷引起的細(xì)胞丟失與體積缺損。
　　第三部分質(zhì)膜修復(fù)對(duì)腦外傷后自噬/溶酶體途徑和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　背景: 腦外傷引起的急性膜損害是關(guān)鍵的上游信號(hào)通路，可能參與了腦外傷后自噬激活和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等繼發(fā)性神經(jīng)損害過(guò)程，如線粒體與溶酶

20、體膜的完整性破壞等。本部分將研究一種非離子型表面活性劑P188對(duì)線粒體與溶酶體膜是否具有修復(fù)作用，探討質(zhì)膜修復(fù)的神經(jīng)保護(hù)作用是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬/溶酶體途徑和細(xì)胞凋亡通路完成的這一新機(jī)制。
　　方法: 本研究采用體外神經(jīng)元離心法，可引起原代培養(yǎng)的神經(jīng)元膜完整性遭到破壞。在損傷后10min，神經(jīng)元分別與P188或一種cathepsin B抑制劑共培養(yǎng)。為了研究P188對(duì)原代神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能的機(jī)制，我們首先采用了光學(xué)顯微鏡觀察，以及

21、MTT和LDH檢測(cè)。線粒體膜電位ΔΨm檢測(cè)可通過(guò)JC-1染色來(lái)完成，同時(shí)檢測(cè)了提純的線粒體Cyt-c與切割型Bid(tBid)的蛋白水平。此外，溶酶體膜完整性檢測(cè)也可采用檢測(cè)提純的溶酶體中cathepsin B與tBid的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果: 腦外傷后P188治療性給藥可增加細(xì)胞的存活率，減輕線粒體膜電位的破壞，能抑制損傷引起的Cyt-c從線粒體中釋放，以及cathepsin B從溶酶體中釋放。采用cathepsin B的抑

22、制劑CBI也能增加神經(jīng)元的存活率，維持線粒體膜穩(wěn)定性，并抑制腦外傷引起的Cyt-c的釋放。P188與CBI治療均能減少溶酶體上層亞組分，以及線粒體亞組分中tBid的表達(dá)水平。
　　結(jié)論: 以上數(shù)據(jù)表明受損的神經(jīng)元遭受了線粒體與溶酶體膜損害，這些機(jī)制可通過(guò)藥物干預(yù)的方法來(lái)探討。P188的神經(jīng)保護(hù)作用可能與cathepsin B與tBid介導(dǎo)的線粒體凋亡啟動(dòng)二者之間的聯(lián)系有關(guān)，即質(zhì)膜修復(fù)劑可通過(guò)修復(fù)受損的線粒體和溶酶體以調(diào)節(jié)自噬/溶酶