1、Marie Unna遺傳性稀毛癥(MUHH，MIM146550)是一種毛發(fā)周期紊亂導(dǎo)致的遺傳病，呈常染色體顯性遺傳。患者出生后毛發(fā)稀少或缺如，兒童期毛發(fā)開始生長，質(zhì)硬、卷曲而無光澤，青春期呈進行性毛發(fā)脫落而不再生長。國際上將MUHH基因座定位于人染色體8p21區(qū)域，但對此區(qū)域中與毛發(fā)周期密切相關(guān)的Hairless(HR)基因編碼區(qū)進行突變篩查時都沒有發(fā)現(xiàn)任何致病性突變。本課題組前期研究證實了MUHH在8p21區(qū)域的定位，并于HR基因5’
2、—UTR區(qū)4個上游開放讀碼框(upstream open reading frame，uORFs)(從5’端至3’端分別命名為U1HR、U2HR、U3HR和U4HR)中的第二個uORF(U2HR)發(fā)現(xiàn)13種MUHH致病突變。本研究挑選其中7種具有代表性的突變作為研究對象(包括1種起始密碼子突變、1種終止密碼子突變、1種無義突變和4種不同的錯義突變)，旨在探討這7種不同的突變對HR基因表達的影響，以及U2HR對HR基因主要開放讀碼框(ma
3、in open reading frame，mORF)表達調(diào)控的分子機制。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，U3HR和U4HR都不影響下游報告基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯效率。但本研究發(fā)現(xiàn)，U1HR和U2HR在分別破壞起始密碼子后雖然都不改變下游報告基因的轉(zhuǎn)錄水平，但前者使翻譯效率降低了近一倍，而后者使翻譯效率提高近3倍。提示U1HR和U2HR可能分別作為一種激活性和抑制性元件調(diào)控下游HR基因mORF的翻譯。 本研究應(yīng)用螢火蟲熒光素酶和EGFP
4、報告基因系統(tǒng)，分析上述7種MUHH致病突變對下游報告基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將這7種突變構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，EGFP報告基因的轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)染野生型后的水平相當(dāng)，但是熒光素酶和EGFP報告基因的翻譯水平卻獲得2～4倍的升高。該實驗結(jié)果提示，U2HR的突變不是通過影響HR基因的轉(zhuǎn)錄水平，而是通過對HR基因翻譯水平的調(diào)控來影響HR蛋白在細(xì)胞中的含量；同時也提示，MUHH發(fā)生的分子機制是：U2HR發(fā)生失去功能性突變，從而喪失對下游H
5、R基因mORF翻譯的抑制，引起HR蛋白過表達。在U2HR調(diào)控下游HR基因mORF翻譯的分子機制研究中，本文首先探討了這種調(diào)控作用是否與U2HR所編碼的氨基酸有關(guān)。利用定點誘變方法在U2HR編碼區(qū)C端產(chǎn)生3種同義突變體，與野生型相比，這3種同義突變體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均未能改變熒光素酶和EGFP報告基因的翻譯水平，提示U2HR對下游HR基因mORF翻譯的調(diào)節(jié)不是依賴U2HR的核苷酸序列，而是依賴于U2HR所編碼的氨基酸序列。 本研究通過
6、消除終止密碼子的方法將U1HR和U2HR分別與EGFP讀碼框融合表達融合蛋白，Western Blot分析可見印跡條帶分子量大小與預(yù)測的相當(dāng)，這間接提示U1HR和U2HR在生理條件下是可翻譯的。隨后在互補實驗(complementary test)中，過表達U2HR多肽并不能挽救U2HR無義突變體導(dǎo)致的對下游報告基因表達抑制作用的喪失，也不能增強野生型U2HR對下游報告基因表達的抑制作用，提示U2HR不是通過反式作用，而是通過順式作用調(diào)
7、控下游HR基因mORF的翻譯。為明確是否U2HR編碼的其他氨基酸也是調(diào)控下游HR基因mORF翻譯所必需，本研究在U2HR編碼區(qū)N端隨機選擇了兩個密碼子進行錯義突變。隨后在報告基因表達水平檢測中發(fā)現(xiàn)，這兩種突變體不影響EGFP報告基因的轉(zhuǎn)錄水平，但均使熒光素酶或EGFP的翻譯效率提高了2倍左右，提示U2HR編碼氨基酸的N端區(qū)域?qū)ο掠蜨R基因mORF的翻譯調(diào)控同樣重要。uORF抑制下游mORF翻譯的可能機制之一是通過其終止密碼子附近的氨基酸
8、阻滯核糖體向下游滑動。為了解U2HR是否可能通過此機制抑制下游HR基因mORF的翻譯，本研究采用定點誘變延長U2HR編碼區(qū)的方法，改變了U2HR終止密碼子附近的氨基酸性質(zhì)，隨后將這種突變體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，觀察其對下游報告基因表達水平的影響。實驗結(jié)果顯示報告基因翻譯水平與轉(zhuǎn)染野生型的相比基本沒有差異，這提示U2HR終止密碼子附近的氨基酸可能不影響核糖體在mRNA上的滑動。本研究還在U2HR起始密碼子AUG下游(+4位)插入單堿基G，形成
9、移碼突變，改變野生型U2HR編碼的包括終止密碼子附近氨基酸在內(nèi)的幾乎所有氨基酸。將該突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染野生型的相比，下游報告基因的轉(zhuǎn)錄水平基本不變，但翻譯效率卻升高了近2倍。該結(jié)果提示U2HR可能通過其編碼的非終止密碼子附近的氨基酸序列影響核糖體在mRNA上的滑動，下調(diào)HR基因mORF翻譯。如果U2HR在生理條件下翻譯為多肽，其可能通過與翻譯裝置中某些組分發(fā)生作用而影響核糖體在mRNA上的滑動。本研究采用酵母雙雜交系統(tǒng)和哺乳動
