遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥與非遺傳性May-Hegglin異常的臨床-分子診斷及發(fā)病機制研究.pdf

1、目的：分析一個遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥(HHT)家系成員的臨床特點,以提高對該病的認(rèn)識和診斷水平。
　　 病例和方法：先證者為一52歲女性患者,反復(fù)鼻衄40余年,先證者之子10歲前即有反復(fù)鼻衄史。先證者及先證者之子均存在嘴唇粘膜、舌粘膜、雙手指掌面皮膚毛細(xì)血管擴張。根據(jù)出血癥狀、毛細(xì)血管擴張部位、家族史等建立了HHT的臨床診斷。對先證者進行血常規(guī)、大小便常規(guī)、肝腎功能等常規(guī)檢查,并行胸部CT、腹部B超及電子胃鏡等檢查,明確是否

2、存在內(nèi)臟受累；結(jié)合家系中其他成員情況,繪制該HHT家系遺傳系譜圖。
　　 結(jié)果：先證者自幼即有自發(fā)性鼻衄,嘴唇粘膜、舌粘膜、手指、手掌面皮膚有結(jié)節(jié)狀血管瘤樣紅斑,為擴張的毛細(xì)血管；實驗室檢查顯示重度貧血,放大電子胃鏡檢查顯示胃底粘膜存在擴張、扭曲的毛細(xì)血管,經(jīng)窄波成像技術(shù)更清晰的顯示出擴張的胃粘膜毛細(xì)血管叢。先證者之子亦有自發(fā)性鼻衄史及毛細(xì)血管擴張表現(xiàn)。先證者及其兒子可明確診斷為HHT。先證者孫子無出血癥狀及毛細(xì)血管擴張。家系中

3、其他成員均無出血史和皮膚粘膜毛細(xì)血管擴張證據(jù),不滿足HHT診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)論：先證者及其兒子可明確診斷為HHT,該病臨床表型上具有異質(zhì)性,遺傳系譜圖提示該家系的HHT表型傳遞符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。
　　 目的：鑒定遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥(HHT)家系致病基因突變位點,探討HHT的分子診斷方法及臨床意義。
　　 方法：(1)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴增先證者及其家系成員外周血ACVRL1,ENG基

4、因及SMAD4基因全部編碼的外顯子序列及鄰近內(nèi)含子序列,并對PCR產(chǎn)物進行正反雙向測序,確定上述基因是否存在突變位點；(2)在發(fā)現(xiàn)先證者及其兒子,孫子存在ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C核苷酸替代后,因該替代破壞了一個StuI限制性內(nèi)切酶酶切位點,對先證者及其家系成員、93例正常對照PCR擴增片段進行StuI限制性內(nèi)切酶圖譜分析,同時對20例正常人該區(qū)域PCR產(chǎn)物行測序分析。
　　 結(jié)果：(1)在ACVRL1基因6

5、號內(nèi)含子區(qū)域,先證者、先證者之子、先證者之孫均存在772+27 G>C突變,而無任何臨床表型的先證者丈夫及兒媳不存在該位點核苷酸替代；在ACVRL1基因編碼區(qū)域,未發(fā)現(xiàn)有意義的核苷酸突變；在ENG基因及SMAD4基因編碼序列亦未發(fā)現(xiàn)有意義的核苷酸突變；(2).ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C突變在113例正常對照中的檢測均為陰性,包括93例正常人PCR產(chǎn)物的StuI限制性內(nèi)切酶圖譜分析及20例正常人PCR產(chǎn)物直接測序。說明

6、該堿基替代為“非多態(tài)性”。
　　 結(jié)論：對HHT致病相關(guān)基因的“全搜索”結(jié)果發(fā)現(xiàn),該家系受累成員存在ACVRL1基因6號內(nèi)含子772+27 G>C替代,在人群中,該替代的發(fā)生率為0/113,說明該位點的核苷酸替代為“非多態(tài)性”,可能為致病相關(guān)突變。
　　 目的：分析ACVRL1基因內(nèi)含子6突變及甲基化對ACVRL1表達水平的影響以及該突變對ENG及VEGF表達水平的影響,闡明該基因突變可能的致病機制。
　　 方法

7、：(1)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該家系成員與正常對照外周血單個核細(xì)胞ACVRL1,ENG及VEGF基因mRNA表達水平；(2)用Western印跡分析該家系成員以及正常人ACVRL1蛋白表達水平；(3)擴增先證者cDNA外顯子6及外顯子7全序列并測序,檢測內(nèi)含子6突變是否影響外顯子6/外顯子7剪接；(4)用Real-time PCR方法,檢測甲基化抑制劑5-氮雜胞苷干預(yù)后先證者外周血單個核細(xì)胞.ACVRL1基因mRNA表達情況；(5

8、)用凝膠電泳遷移試驗(EMSA)研究ACVRL1內(nèi)含子6突變序列對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：(1)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,家系中受累成員ACVRL1 mRNA表達較正常人顯著降低,而ENG及VEGF基因mRNA表達水平較正常人顯著增高；(2)家系中受累成員ACVRL1蛋白表達較家系中非HHT患者及正常人顯著降低；(3)ACVRL1 cDNA擴增外顯子6與外顯子7相應(yīng)序列測序結(jié)果無異常,顯示772+27 G>C突變不影

9、響外顯子6/外顯子7剪接；(4)先證者單個核細(xì)胞甲基化抑制劑干預(yù)后ACVRL1 mRNA表達仍明顯下調(diào),與未干預(yù)細(xì)胞比較無顯著差異,表明突變區(qū)域核苷酸甲基化并不影響ACVRL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(5)EMSA結(jié)果顯示核轉(zhuǎn)錄因子SP1可與野生型探針結(jié)合,不能與突變型探針結(jié)合,提示ACVRL16號內(nèi)含子772+27 G>C突變導(dǎo)致與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力下降。
　　 結(jié)論： ACVRL16號內(nèi)含子772+27 G>C突變導(dǎo)致ACVRL1基因及蛋白

10、表達下調(diào),影響與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力可能為該家系HHT的發(fā)病機制。
　　 目的：對1例May-Hegglin異常(MHA)先證者非肌性肌球蛋白重鏈9基因(MYH9)突變位點進行篩選,并對其無臨床及血液學(xué)表型的家系成員進行基因分析,以確定先證者MYH9基因突變與其父母該基因位點的遺傳關(guān)系。
　　 病例與方法：(1)先證者為29歲女性,因血小板計數(shù)減少、巨大血小板和中性粒細(xì)胞包涵體而診斷為May-Hegglin異常。其有血緣關(guān)系

11、的父母、兄長血小板計數(shù)均正常,外周血涂片未發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞包涵體及巨大血小板,臨床無出血傾向；(2)用透射電鏡觀察先證者外周血粒細(xì)胞包涵體；用掃描電鏡觀察其外周血巨大血小板形態(tài)；(3)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增患者及其父母MYH9基因突變熱點區(qū)域,并對PCR產(chǎn)物進行正反向測序,確定其突變位點。
　　 結(jié)果：(1)先證者具有典型的“血小板減少、巨大血小板、中性粒細(xì)胞包涵體”三聯(lián)征,MHA診斷成立；而患者父母及兄長顯然為健康正常

12、者；(2)透射及掃描電鏡觀察證實先證者外周血存在巨大血小板及粒細(xì)胞包涵體；(3)先證者MYH9基因40號外顯子第5797位核苷酸存在C>T突變,該突變導(dǎo)致編碼的非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA(NMMHC-ⅡA)蛋白第1933位精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(R1933X)；先證者MYH9基因33號外顯子存在4876A>G雜合突變；先證者父母均未檢測出R1933X突變,其母不存在4876A>G多態(tài)性,其父為4876A>G多態(tài)性的純合子。
　　 結(jié)