玫瑰糠疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、TLR9mRNA及其下游MyD88、TRIFmRNA的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:本課題應(yīng)用SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)玫瑰糠疹(pityriasisrosea，PR)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(theperipheralbloodmononuclearcells，PBMC)中TLR4、TLR9mRNA及其下游MyD88、TRIFmRNA的表達(dá)狀況，從免疫角度探討TOLL樣受體在玫瑰糠疹發(fā)病機(jī)制中的意義。PR是一種臨床常見的炎癥性皮膚病，病程6-8周，具有自限性，其特征性表現(xiàn)是長(zhǎng)軸與皮紋一致的

2、圓形或橢圓形附有糠狀鱗屑的玫瑰色、鮮紅色或黃紅色的斑疹或丘疹。PR的病因不明，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前多認(rèn)為與病毒感染和細(xì)胞免疫有關(guān)。
　　 機(jī)體在抵御病原體的入侵時(shí)有兩套免疫防御機(jī)制:固有性免疫和適應(yīng)性免疫[1]。固有性免疫是宿主防御的第一道防線。固有性免疫應(yīng)答利用皮膚和粘膜上皮這兩個(gè)物理屏障來避免感染并迅速作出應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答是由T和B細(xì)胞介導(dǎo)的相對(duì)較慢的過程，由于復(fù)雜的DNA重組使得其抗原受體高度多樣化，因此它既能識(shí)別異

3、常的抗原也能識(shí)別保守的抗原。固有性免疫通過病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)識(shí)別病原體，哺乳動(dòng)物中負(fù)責(zé)識(shí)別PAMPs的受體稱為模式識(shí)別受體（patternrecognitionreceptors，PRRs）。TOLL樣受體(Toll-likereceptors，TLRS)是固有性免疫系統(tǒng)中一種重要的模式識(shí)別受體，它們完全是種系編碼并以既定的形式表達(dá)于免疫和非免疫細(xì)胞[

4、1]。TLRS是近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)，它們分布廣泛，既可以表達(dá)于免疫細(xì)胞也可以表達(dá)于非免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是固有性免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。當(dāng)TLRS識(shí)別病原體后便可介導(dǎo)固有免疫的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并激活多種促炎癥因子如IL-12、TNF-α，進(jìn)而參與抗感染的炎癥過程。此外，TLRS還可以通過細(xì)胞因子（如TNF-a、IL-1）、趨化因子（如IL-8、MIP2）、協(xié)同刺激分子（如CD-40、CD-80）和粘附分子（如ICAM-1）的產(chǎn)生[2-4]和上

5、調(diào)抗原提呈細(xì)胞表面共刺激分子（如CD80/CD86）的表達(dá)，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起調(diào)節(jié)作用[5、6]。其中TLR4主要分布于抗原提呈細(xì)胞，革蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分脂多糖是它的配體。TLR9表達(dá)于許多人類細(xì)胞，低甲基化的胞嘧啶磷酸鳥核苷酸(cytosinephosphateguanosine，CpG)DNA是它的配體，這種基序普遍存在于細(xì)菌及病毒的DNA中，但在哺乳動(dòng)物中卻極為罕見。TLRS依賴于胞漿外區(qū)的接頭蛋白分子和激酶進(jìn)行信號(hào)

6、轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)接頭蛋白的不同分為MyD88(Myeloiddifferentiationfactor-88，髓樣分化因子88)依賴性途徑和TRIF（Toll-IL-IRdomain-containingadaptor-inducinginterferon-β，誘導(dǎo)干擾素β的含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白）依賴性途徑。TLR4既可以通過MyD88依賴性途徑也可以通過TRIF依賴性途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);TLR9僅通過MyD88依賴性途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來

7、，TLRS在皮膚炎癥、皮膚惡性腫瘤和防御機(jī)制方面都有著重大進(jìn)展。
　　 方法:病例組:26例玫瑰糠疹患者;對(duì)照組:20例健康人群。病例組:均來自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科門診，男12例，女14例，平均年齡:22.5歲，病程3天-1月，患者入選標(biāo)準(zhǔn):(1)均有典型的臨床表現(xiàn):胸背部與皮紋長(zhǎng)軸一致的黃紅色圓形或橢圓形境界清楚的斑疹或丘疹;(2)受試前臨床檢查無其他免疫相關(guān)性疾病、過敏性疾病、腫瘤和其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病;(3)1個(gè)月內(nèi)無

8、系統(tǒng)用藥史，未服用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素及抗組胺藥。對(duì)照組:20例均無過敏性疾病、自身免疫性疾病及家族史的健康人群，其性別、年齡與病例組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究采用SYBRGreen(I)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)病例組與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR4、TLR9及MyD88、TRIFmRNA的表達(dá)狀況，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選用的是正態(tài)性檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)中的M

9、ann-Whitney檢驗(yàn)，定量數(shù)據(jù)用中位數(shù)或四分位數(shù)表示。
　　 結(jié)果:
　　 1.TLR4的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)P＜0.1，不服從正態(tài)分布，結(jié)果用中位數(shù)或四分位數(shù)間距表示。病例組與正常對(duì)照組TLR4的mRNA表達(dá)水平的RQ值分別是8.102/11.87;7.275/4.96，采用秩和檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P=0.09＞0.05)，所以尚不能認(rèn)為兩組TLR

10、4的mRNA表達(dá)水平有差別。
　　 2.TLR9的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)P＜0.1，不服從正態(tài)分布，結(jié)果用中位數(shù)或四分位數(shù)間距表示。病例組與正常對(duì)照組TLR9mRNA表達(dá)水平的RQ值分別是:1.592/3.86;3.13/8.93，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異(P=0.03＜0.05)。
　　 3.MyD88的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)P＜0.1，不服從正態(tài)分布，

11、結(jié)果用中位數(shù)或四分位數(shù)間距表示。病例組與正常對(duì)照組MyD88mRNA表達(dá)水平的RQ值分別是1.5005/1.445;1.7445/1.297，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P=0.36＞0.05)，所以尚不能認(rèn)為兩組MyD88的mRNA表達(dá)水平有差別。
　　 4.TRIF的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)P＜0.1，不服從正態(tài)分布，結(jié)果用中位數(shù)或四分位數(shù)間距表示。病例組與正常對(duì)照組TLR4

12、的mRNA表達(dá)水平的RQ值分別是3.0115/4.431;3.443/5.970，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(P=0.23＞0.05)，所以尚不能認(rèn)為兩組TRIF的mRNA表達(dá)水平有差別。
　　 結(jié)論:
　　 1.玫瑰糠疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的TLR4mRNA與TRIFmRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），表明病例組與正常對(duì)照組TLR4mRNA與TRIFmR

13、NA表達(dá)水平無差別，推測(cè)玫瑰糠疹的發(fā)病可能與革蘭氏陰性菌感染無關(guān)。
　　 2.玫瑰糠疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的TLR9mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明玫瑰糠疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的TLR9mRNA低于正常對(duì)照組，原因可能是機(jī)體存在某些特定DNA序列抑制了TLR9的表達(dá)。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)TLR9可能參與了玫瑰糠疹的發(fā)病。
　　 3.玫瑰糠疹患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的MyD88mRNA表達(dá)