TIPE2、TLR2及TLR4mRNA在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)為單股正鏈RNA病毒，全長大約為9.6kb。目前全世界近3％的人口為HCV感染者，其中50-85％以上的患者由急性轉(zhuǎn)為慢性持續(xù)性感染，甚至發(fā)展為肝硬化、肝癌。研究發(fā)現(xiàn)固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)均參與了HCV感染、清除以及慢性化過程，但其確切的機(jī)制尚不完全清楚。TIPE2(tumor necrosisfactor-α-induced protein8-like2，TNFAI

2、P8L2)，即腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8型-2，是新近發(fā)現(xiàn)的免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要調(diào)節(jié)器，負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)和Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。作為一種負(fù)性調(diào)節(jié)子，TIPE2在慢性乙型肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸癌等多種疾病患者外周血和組織中表達(dá)異常，并且影響這些疾病發(fā)生和進(jìn)展過程。但是TIPE2是否參與慢性丙型肝炎(簡稱慢丙肝)的發(fā)病過

3、程以及在慢丙肝免疫機(jī)制中起怎樣作用尚未見報(bào)道。TLRs是一類重要的跨膜病原體識(shí)別受體，主要識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌、衣原體等病原微生物和壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)外源性產(chǎn)物，激活固有免疫反應(yīng)。同時(shí)TLRs作為“橋梁”連接固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)，參與維持機(jī)體免疫功能的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。為進(jìn)一步研究TIPE2、TLR2和TLR4在慢丙肝發(fā)病機(jī)制中的作用及三者間是否相互影響，我們檢測了慢丙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononu

4、clear cells，PBMCs)中TIPE2、TLR2及TLR4的表達(dá)情況，并與慢丙肝患者的臨床療效進(jìn)行對(duì)比觀察，為進(jìn)一步揭示慢丙肝的發(fā)病機(jī)制及臨床抗病毒治療靶點(diǎn)的選擇奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1病例選擇
　　慢丙肝患者60例，男22例，女38例，平均年齡為43.51±14.90歲，均為2009年12月至2011年10月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西結(jié)合肝病科門診和住院患者，診斷均符合2000年9月西安會(huì)議修訂的病毒性

5、肝炎防治方案標(biāo)準(zhǔn)[1]及2004年丙型肝炎防治指南修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。同時(shí)排除其他合并病毒性肝炎及肝臟疾病。同期選擇健康志愿者30人，男13例，女17例，平均年齡為39.23±11.53歲。所有患者及志愿者均清晨空腹抽取抗凝靜脈血7ml，用于分離PBMCs及T細(xì)胞亞群檢測。抽取不抗凝靜脈血5ml，分離血清備用。
　　2治療方法
　　慢丙肝患者給予干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，根據(jù)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞減少情況，給予升白細(xì)胞藥物

6、治療。肝功能異常者給予保肝降酶、退黃等治療。
　　3外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIPE2、TLR2、TLR4基因檢測
　　Ficoll密度梯度離心法常規(guī)分離PBMCs，Trizol一步法提取PBMCs中總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測量RNA，吸光度(A)260/(A)280nm的值為1.8-2.0時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成制備cDNA，應(yīng)用Primei Premier5.0軟件設(shè)計(jì)合成特異性引物，RT-PCR檢測檢測TI

7、PE2、TLR2及TLR4mRNA的表達(dá)。
　　4血清檢測
　　留取慢丙肝患者不抗凝靜脈血5ml，分離血清，全自動(dòng)生化儀酶法檢測肝功能，ELISA法測抗-HCV，實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針法檢測HCVRNA。
　　5 T細(xì)胞亞群檢測
　　留取清晨空腹抗凝靜脈血2ml，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞。
　　結(jié)果：
　　1慢丙肝患者PBMCs中TIPE2基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)

8、系
　　結(jié)果顯示慢丙肝患者PBMCs中TIPE2 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著降低(0.49±0.17 vs1.06±0.30，P＜0.05)；其中42例慢丙肝患者在抗病毒治療前后分別檢測，結(jié)果顯示PBMCs中TIPE2 mRNA水平治療后較治療前明顯升高(0.41±0.11 vs0.66±0.25，P＜0.01)。
　　2慢丙肝患者PBMCs中TLR2基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)系
　　慢丙肝患者PBMCs中T

9、LR2 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高(1.86±0.35 vs1.24±0.30，P＜0.05)；42例慢丙肝患者在抗病毒治療前后分別檢測，結(jié)果顯示PBMCs中TLR2 mRNA水平治療后較治療前明顯下降(1.94±0.33 vs1.37±0.19，P＜0.01)。
　　3慢丙肝患者PBMCs中TLR4基因的表達(dá)及與抗病毒治療的關(guān)系
　　慢丙肝患者PBMCs中TLR4 mRNA的表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高(1.5

10、9±0.64 vs0.93±0.26，P＜0.05)；42例慢丙肝患者抗病毒治療前后分別檢測，結(jié)果顯示PBMCs中TLR4 mRNA水平治療后較治療前明顯下降(1.58±0.56 vs1.16±0.15，P＜0.01)。
　　4 TIPE2基因的表達(dá)與慢性丙型肝炎臨床指標(biāo)的相關(guān)性
　　分析慢丙肝患者臨床病例，依據(jù)慢丙肝患者血清中HCV RNA、ALT、AST、Tbil水平，將其分為HCV RNA低拷貝組(HCV RNA≤1×

11、104copies/mL)和HCV RNA高拷貝組(HCV RNA＞1×104copies/mL)；ALT低水平組(ALT≤80IU/mL)和高水平組(ALT＞80U/mL)；AST低水平組(AST≤80IU/mL)和高水平組(AST>80U/mL)以及Tbil正常組(Tbil≤17.1 umol/L)和異常組(Tbil＞17.1umol/L)，統(tǒng)計(jì)分析顯示，慢丙肝患者PBMCs中TIPE2的mRNA表達(dá)水平在低水平組顯著高于高水平組(

12、HCV RNA，0.66±0.16 vs0.44±0.11，P＜0.05；ALT，0.59±0.13 vs0.33±0.06，P＜0.05：AST，0.57±0.14 vs0.33±0.07，P＜0.05；Tbil，0.58±0.14 vs0.34±0.07，P＜0.01)，且與HCVRNA、ALT、AST水平呈負(fù)相關(guān)(HCV RNA，r=-0.658，P＜0.01：ALT，r=-0.961，P＜0.01；AST，r=-0.924，P＜

13、0.01)，與Tbil水平無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　5 TIPE2的表達(dá)與TLR2、TLR4表達(dá)的相關(guān)性
　　進(jìn)一步應(yīng)用SPSS13.0分析顯示，TIPE2的表達(dá)與TLR2、TLR4呈負(fù)相關(guān)(TLR2，r=-0.669，P＜0.01；TLR4，r=-0.649，P＜0.01)。
　　6慢丙肝患者外周血T細(xì)胞亞群的變化及與TIPE2基因的關(guān)系
　　與健康對(duì)照組相比，慢丙肝患者外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞

14、亞群降低、CD8+T細(xì)胞亞群升高，CD4+/CD8+降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(CD3+，64.28±10.39 vs70.97±3.80，P＜0.05；CD4+，33.60±5.26 vs44.66±3.62，P<0.05：CD8+，29.59±6.47 vs25.63±4.03，P<0.05；CD4+/CD8+，1.19±0.35 vs1.78±0.34，P＜0.05)，且TIPE2 mRNA水平與CD4+T細(xì)胞呈正相關(guān)(CD4+，r=0

15、.735，P＜0.01)，與CD8+T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(r=-0.625，P＜0.01)，與CD4+/CD8+比值呈正相關(guān)(r=0.804，P＜0.01)，與CD3+T細(xì)胞無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1慢丙肝患者PBMCs中TIPE2基因的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照者，接受抗病毒治療后表達(dá)水平升高。
　　2慢性丙型肝炎患者PBMCs中TLR2、TLR4基因的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照者，抗病毒治療后表達(dá)水平