BATF和TIPE2在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者中的表達(dá)及意義.pdf

1、第一部分:慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者BATF高表達(dá)與Th17免疫反應(yīng)增強(qiáng)的相關(guān)性研究
　　研究背景：
　　乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)是一種嗜肝的非細(xì)胞毒性DNA病毒。目前全球約有3.5億至4億慢性HBV感染者，其中部分患者在促發(fā)因素的作用下，病情急性加重，迅速進(jìn)展為慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronichepatitis Bliver failure，ACHBLF)。ACHBL

2、F是指在慢性HBV感染的基礎(chǔ)上，肝功能急劇、嚴(yán)重惡化，患者臨床表現(xiàn)以黃疸和凝血障礙為主，并于4周內(nèi)出現(xiàn)腹水和/或肝性腦病。宿主和病毒雙重因素的協(xié)同作用決定ACHBLF的疾病進(jìn)展，其中免疫因素逐漸被重視，在ACHBLF的疾病過程中起到關(guān)鍵作用。我們的前期研究檢測了輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞亞群在ACHBLF發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者Th17細(xì)胞亞群比例增加，其效應(yīng)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17(IL-17)增多，Th1

3、7免疫反應(yīng)增強(qiáng)與患者病情進(jìn)展和預(yù)后明顯相關(guān)。我們進(jìn)一步探討了Th17細(xì)胞增多的可能原因，發(fā)現(xiàn)堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF樣蛋白(basic leucinezipper transcription factor,ATF-like，BATF)可能是調(diào)節(jié)慢加急性乙型肝炎肝衰竭Th17免疫反應(yīng)的分子靶標(biāo)。BATF屬于激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子超家族，在多種免疫細(xì)胞的分化發(fā)育和免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換中發(fā)揮了重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BATF是調(diào)控Th17細(xì)

4、胞增殖分化和IL-17產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，介導(dǎo)疾病免疫損傷。然而，ACHBLF患者體內(nèi)BATF表達(dá)的變化及其與Th17免疫應(yīng)答的關(guān)系尚不清楚。
　　研究目的：
　　1.探討ACHBLF患者外周血BATF基因和蛋白表達(dá)水平的變化;
　　2.探討ACHBLF患者BATF表達(dá)水平與肝臟炎癥損傷程度以及Th17免疫應(yīng)答的關(guān)系。
　　研究方法：
　　本研究共納入22例ACHBLF患者，60例慢性乙型肝炎(chronic

5、hepatitisB，CHB)患者以及17例健康對照作為研究對象。應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測ACHBLF患者、CHB患者及健康對照外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononu clearcells，PBMCs)中BATF及IL-17、IFN-γ、RORγt和T-betmRNA表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD3+BAT

6、F+T細(xì)胞及Th1、Th17和Tc1細(xì)胞比例。另外收集了26例行經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)的CHB患者及6例健康肝移植供者的肝組織，應(yīng)用免疫組化方法檢測BATF在肝組織內(nèi)的表達(dá)及定位。
　　研究結(jié)果：
　　1.ACHBLF患者PBMCs中BATFmRNA表達(dá)明顯高于健康對照和CHB患者（P＜0.01，P＜0.05），CHB患者BATFmRNA表達(dá)較健康對照也明顯增高（P＜0.01）。
　　2.ACHBLF患者PBMCs中BATF

7、mRNA水平與患者總膽紅素水平呈正相關(guān)（r=0.477，P=0.025）;CHB患者BATFmRNA水平與患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平、HBV-DNA病毒量呈正相關(guān)(r=0.497，P＜0.001;r=0.340，P=0.008)。
　　3.ACHBLF患者外周血CD3+BATF+細(xì)胞比例明顯高于健康對照和CHB患者（P＜0.01，P＜0.01），CHB患者CD3+BATF+細(xì)胞比例也較健康對照增高(P＜0.01)。三組研究對象CD3+T細(xì)

8、胞中BATF蛋白平均熒光強(qiáng)度也表現(xiàn)出相同的變化趨勢(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。
　　4.ACHBLF患者和CHB患者外周血CD3+BATF+T細(xì)胞比例與Th17細(xì)胞比例呈正相關(guān)(r=0.338，P=0.002);外周血單個核細(xì)胞中Th17細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17及轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA水平也與CD3+BATF+T細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)(r=0.303，P=0.006;r=0.256，P=0.020)。

9、　　5.BATF陽性細(xì)胞在CHB患者肝臟門脈區(qū)聚集。與健康對照相比，CHB患者肝臟浸潤BATF陽性細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)，并且BATF陽性細(xì)胞數(shù)目隨肝臟炎癥程度增高而增多(P＜0.05)。另外，11例應(yīng)用抗病毒藥物治療6個月后出現(xiàn)生物學(xué)應(yīng)答和病毒性應(yīng)答的CHB患者中，治療后外周血單個核細(xì)胞BATFmRNA水平較治療前明顯降低(P=0.01)。
　　結(jié)論：
　　ACHBLF患者、CHB患者外周血和肝組織內(nèi)BATF表達(dá)明顯

10、增高，并且與肝臟炎癥損傷程度相關(guān)，提示BATF在HBV感染慢性化和重癥化中均發(fā)揮作用?；颊連ATF表達(dá)水平與Th17免疫應(yīng)答強(qiáng)度正相關(guān)，BATF可能通過上調(diào)Th17免疫反應(yīng)，參與介導(dǎo)肝臟免疫損傷。
　　第二部分:TIPE2在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)及其與疾病預(yù)后的關(guān)系
　　研究背景：
　　免疫負(fù)調(diào)控分子表達(dá)異常是ACHBLF免疫穩(wěn)態(tài)失衡的另一重要原因。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者出現(xiàn)“免

11、疫麻痹”。這種免疫抑制由多種免疫調(diào)節(jié)分子和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞參與介導(dǎo)，可能是機(jī)體對早期過度促炎癥反應(yīng)的拮抗效應(yīng)。腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8型-2(tumornecrosisfactor-α-inducedprotein8-like2，TNFAIP8L-2，TIPE2)是最近發(fā)現(xiàn)的一種免疫調(diào)控分子，主要表達(dá)于免疫器官和淋巴組織中，不同發(fā)育階段的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞中均有TIPE2表達(dá)。TIPE2基因缺陷細(xì)胞表現(xiàn)出對T細(xì)胞受體和Toll樣受

12、體信號活化的高反應(yīng)性，說明TIPE2可以負(fù)性調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TIPE2的正常表達(dá)是阻止免疫反應(yīng)過激和維持免疫穩(wěn)態(tài)所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和慢性乙型肝炎等免疫炎癥疾病中具有重要作用。TIPE2參與HBV引起的肝臟免疫損傷，但TIPE2在ACHBLF患者中的表達(dá)改變及意義目前尚無研究。
　　研究目的：
　　1.探討ACHBLF患者外周血單個核細(xì)胞中TIPE2mRNA的表達(dá)改變，以及TIPE2與

13、ACHBLF病情嚴(yán)重程度和疾病預(yù)后的關(guān)系;
　　2.初步探討TIPE2影響ACHBLF病情發(fā)展的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　本研究共納入56例ACHBLF患者，60例CHB患者和24例健康對照者。我們對ACHBLF患者進(jìn)行了3個月隨訪，根據(jù)患者3個月后的生存情況將患者分為存活組和死亡組。通過密度梯度離心法提取研究對象外周血單個核細(xì)胞，Trizol提取總RNA，采用RT-PCR法檢測PBMCs中TIPE2mRNA的相

14、對表達(dá)水平。另外，體外培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞，檢測應(yīng)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后單個核細(xì)胞中TIPE2、IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平。促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α是單個核細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，其體外分泌水平被認(rèn)為可以代表機(jī)體細(xì)胞免疫水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.ACHBLF患者PBMCs中TIPE2mRNA水平明顯高于健康對照組(P＜0.05)和CHB患者（P＜0.01）。與

15、健康對照相比，CHB患者TIPE2mRNA水平降低(P＜0.05)。
　　2.ACHBLF患者TIPE2mRNA表達(dá)水平與患者總膽紅素水平(r=0.300，P=0.024)、凝血酶原時間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（r=0.301，P=0.024）和終末期肝病模型積分（r=0.335，P=0.011）呈明顯正相關(guān)關(guān)系，與谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、肌酐水平、凝血酶原活動度、HBV-DNA病毒量和HBeAg均不具有相關(guān)性。
　　3.ACHBLF死

16、亡組患者TIPE2表達(dá)明顯高于存活組患者（P＜0.01）。用TIPE2預(yù)測ACHBLF患者預(yù)后，其受試者工作特征曲線下面積為0.721(95％CI0.572-0.870)。我們進(jìn)一步研究了ACHBLF患者TIPE2表達(dá)的動態(tài)改變。收集32例ACHBLF患者入院第二天、第一周、第二周和第三周的連續(xù)血樣標(biāo)本，研究發(fā)現(xiàn)，18例存活患者入院三周內(nèi)PBMCsTIPE2表達(dá)隨病情好轉(zhuǎn)降低，而14例死亡患者TIPE2表達(dá)不降反而升高。
　　4.

17、TIPE2與ACHBLF患者細(xì)胞免疫功能下降有關(guān)。與健康對照和CHB患者相比，ACHBLF患者體外刺激的單個核細(xì)胞TIPE2mRNA表達(dá)水平明顯增高（P均＜0.05），相反，IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05），在死亡組ACHBLF患者中這種趨勢更為明顯。另外，LPS刺激后外周血單個核細(xì)胞中TIPE2與TNF-α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.337，P=0.048）。
　　結(jié)論:
　　TIPE2在慢性