基于等溫酶擴(kuò)增反應(yīng)的免標(biāo)記化學(xué)發(fā)光miRNA檢測新方法.pdf

1、MicroRNAs(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA,長約19～25個核苷酸(nt)。miRNA是基因表達(dá)的重要小分子，多種生理學(xué)和病理學(xué)的過程都受其調(diào)控，其表達(dá)水平與疾病的診斷、分期、預(yù)后及治療等密切相關(guān)。本論文第一章概述了miRNA檢測新方法的研究進(jìn)展，隨后闡述了本論文的主要研究內(nèi)容及創(chuàng)新點(diǎn);第二章將指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)與瞬時(shí)衍生化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)偶合，以鏈霉親合素適配體作為信號分子，實(shí)現(xiàn)了let-7a的高靈敏度檢測。詳

2、細(xì)優(yōu)化了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并比較了模板上有無內(nèi)切酶位點(diǎn)的滾環(huán)擴(kuò)增以及線性擴(kuò)增的效率;模板優(yōu)化篩選后發(fā)現(xiàn):采用含有兩個鏈霉親合素適配體互補(bǔ)鏈和一個let-7a的識別序列合計(jì)三個酶切位點(diǎn)的模板，能夠?qū)崿F(xiàn)高效率的滾環(huán)信號擴(kuò)增，得以產(chǎn)生大量的鏈霉親合素適配體序列;隨后采用鏈霉親合索修飾的磁性微球，富集以上的鏈霉親合素適配體序列，利用3，4，5-三甲基苯甲酰甲醛(TMPG)與適配體上G堿基的特異性瞬時(shí)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了let-7a的定量檢測，線性范

3、圍為10amol-100 fmol，檢測限可達(dá)5 amol。第三章針對let-7家族序列相似度極高、難以識別的特點(diǎn)，將Padlock序列上目標(biāo)let-7a識別區(qū)域進(jìn)行單堿基突變，篩選了突變位點(diǎn)，以適度犧牲let-7a信號強(qiáng)度為代價(jià)，很好地提高了let-7家族的錯配識別能力，從而建立了一種基于單堿基突變的let-7a高選擇性識別檢測方法。以上方法的構(gòu)建，為解決miRNA高靈敏度高特異性識別提供了一種可能的途徑，并有望拓寬到其它miRNA或