MicroRNA-34b-5p調(diào)控發(fā)育期驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬miRNA差異表達(dá)譜分析
　　目的：篩選發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬差異表達(dá)的miRNAs，為進(jìn)一步探討miRNA在發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生機(jī)制中的作用提供依據(jù)。
　　方法：健康清潔20日齡SD大鼠16只，隨機(jī)分為正常對照組和驚厥組，每組8只大鼠。三氟乙醚反復(fù)吸入（每天一次，連續(xù)6天）制作發(fā)育期驚厥模型，對照組除不吸入三氟乙醚外，其他處理同驚厥組。反復(fù)驚厥后1d大鼠斷頭取腦，分離海馬組織，提取總RN

2、A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，TaqMan(R)MicroRNA Array方法篩選出驚厥組與對照組大鼠海馬差異表達(dá)的miRNAs，并利用實(shí)時(shí)定量PCR對部分差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行二次驗(yàn)證。
　　結(jié)果：TaqMan(R)MicroRNA Array檢測發(fā)現(xiàn)有30個(gè)miRNAs在驚厥組和對照組海馬組織中表達(dá)差異顯著，差異倍數(shù)大于2倍以上。其中9個(gè)miRNAs上調(diào)，21個(gè)miRNAs下調(diào)。上調(diào)顯著的miRNAs有:miR-34b-5p、miR-2

3、04等;下調(diào)顯著的有miR-582-3p，miR-672等。實(shí)時(shí)定量PCR對差異表達(dá)的miR-34b-5p、miR-204、miR-582-3p、miR-672進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與TaqMan低密度芯片結(jié)果趨勢一致，表明芯片結(jié)果可靠，提示miR-34b-5p、miR-204等miRNAs參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷的發(fā)生過程。
　　結(jié)論：MiR-34b-5p、miR-204等部分miRNAs在發(fā)育期驚厥組和正常對照海馬組織中存在顯著差異表

4、達(dá)，提示它們可能參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生的分子機(jī)制。
　　第二部分 MicroRNA-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在驚厥后海馬的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義
　　目的：研究發(fā)育期大鼠反復(fù)驚厥后海馬組織miR-34b-5p及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，探討miR-34b-5p在發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法：96只20日齡健康Spr

5、ague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為2組:正常對照組和驚厥組。通過三氟乙醚反復(fù)吸入（連續(xù)6次，每天1次）制作發(fā)育期大鼠驚厥動(dòng)物模型。用qRT-PCR方法檢測反復(fù)驚厥后2h、6h、1d、3d、7d海馬組織中miR-34b-5p的表達(dá);Western Blot方法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，反復(fù)驚厥后2h-1d海馬miR-34b-5p的表達(dá)均較對照組顯著

6、增高(P＜0.01)，3d、7d時(shí)逐漸恢復(fù)至正常水平(P＞0.05)。(2) Western blot結(jié)果顯示，反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bcl-2蛋白水平與對照組相比無顯著變化(P＞0.05)，6h較對照組顯著降低，1d時(shí)進(jìn)一步下調(diào)，7d時(shí)下降最顯著(P＜0.01);而反復(fù)驚厥后Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢，反復(fù)驚厥后2h大鼠海馬Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白水平較

7、對照組顯著升高，6h表達(dá)量更高，1d時(shí)升高最明顯，3d、7d時(shí)仍顯著高于對照組(P＜0.01);Bax/Bcl-2的比值在反復(fù)驚厥后各時(shí)間點(diǎn)皆顯著高于對照組（P＜0.01）。
　　結(jié)論：反復(fù)驚厥后早期海馬miR-34b-5p的表達(dá)顯著增強(qiáng)，同時(shí)伴有促凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3活性蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，Bax/Bcl-2的比值升高，而抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)降低，提示miR-34b-5p可能在發(fā)育期驚厥性腦損傷后早期神經(jīng)

8、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 MicroRNA-34b-5p的靶基因預(yù)測及驗(yàn)證
　　目的：預(yù)測并驗(yàn)證miR-34b-5p作用的靶基因，進(jìn)一步了解miR-34b-5p的生物學(xué)功能及在發(fā)育期驚厥性腦損傷中的作用機(jī)制。
　　方法：利用靶基因預(yù)測軟件分析得到miR-34b-5p作用的靶基因。構(gòu)建野生型靶基因3'-UTR和變型靶基因3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，將這兩個(gè)載體分別與miR-34b-5p mimics或

9、miR-34b-5p陰性載體(miR-34b-5p m NC)共同轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測熒光素酶活性變化以證實(shí)該靶基因是否為miR-34b-5p作用的靶基因。
　　結(jié)果：(1)軟件預(yù)測Bcl-2基因?yàn)閙iR-34b-5p作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染miR-34b-5pmNC相比，共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics和野生型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性顯著下降，而轉(zhuǎn)染突變型Bcl-23'-UTR的

10、熒光素酶活性則無明顯變化，證實(shí)Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了野生型和突變型Bcl-23'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體;軟件預(yù)測并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。
　　第四部分 MicroRNA-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制
　　目的：研究miR-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，闡明mi

11、R-34b-5p調(diào)控驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。
　　方法：(1)原代分離培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，以海人酸干預(yù)誘導(dǎo)細(xì)胞驚厥。應(yīng)用TUNEL染色檢測不同濃度海人酸對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)海人酸處理用濃度。并以實(shí)時(shí)定量PCR檢測海人酸干預(yù)后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-34b-5p表達(dá)水平的改變，Western Blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)水平的改變。(2)利用脂質(zhì)體將

12、miR-34b-5p模擬物(miR-34b-5pmimics)、miR-34b-5p抑制劑（miR-34b-5p inhibitors）以及相對應(yīng)的陰性對照（miR-34b-5p m NC、miR-34b-5p i NC）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后miR-34b-5p的表達(dá)。并檢測海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化。Bcl-2 mRNA的表達(dá)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測;海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡用T

13、UNEL染色進(jìn)行檢測;凋亡相關(guān)指標(biāo)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)用Western Blot檢測。(3)分別將control siRNA、Bcl-2siRNA、miR-34b-5p inhibitors以及Bcl-2 siRNA+ miR-34b-5p inhibitors轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，并用海人酸進(jìn)行干預(yù)，Western Blot檢測Bcl-2沉默后對海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。
　　

14、結(jié)果：(1)海人酸誘導(dǎo)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡顯著增加，其miR-34b-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯受到抑制;凋亡相關(guān)基因Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著升高，Bax/Bcl-2的比值顯著增加。(2)與空白對照及轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mNC的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mimics的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)顯著增加，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率

15、、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著增加，而Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低;而轉(zhuǎn)染了miR-34b-5pinhibitors的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-34b-5p的表達(dá)顯著降低，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)則顯著增加。(3)miR-34b-5p負(fù)性調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達(dá)

16、，但對Bcl-2 mRNA的表達(dá)無影響。(4) miR-34b-5p inhibitors顯著降低Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達(dá)，而Bcl-2 siRNA和miR-34b-5pinhibitors共轉(zhuǎn)染后Caspase-3（19kD/17kD）活性蛋白的表達(dá)顯著高于miR-34b-5p inhibitors組，表明Bcl-2 siRNA的轉(zhuǎn)染能阻斷miR-34b-5pinhibitors導(dǎo)致的Caspase-3(

17、19kD/17kD)活性蛋白的降低。
　　結(jié)論：(1)海人酸誘導(dǎo)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程中，miR-34b-5p表達(dá)顯著增加。(2)成功構(gòu)建了miR-34b-5p過表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞模型，過表達(dá)miR-34b-5p能夠促進(jìn)驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，抑制miR-34b-5p的表達(dá)可以阻礙驚厥后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。(3)miR-34b-5p通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因Bcl-2表達(dá)，從而促進(jìn)Caspase-3活化，激活Caspase信