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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:觀察粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)對(duì)D-半乳糖胺/脂多糖(D-GalN/LPS)所致小鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用,探討G-CSF在肝衰竭中治療作用及其抗凋亡可能機(jī)制。
方法:
1、采取腹腔注射D-GalN/LPS制造小鼠急性肝衰竭模型。選取三個(gè)可能影響造模成功率的指標(biāo)為實(shí)驗(yàn)因素:D-GalN劑量、LPS劑量、稀釋倍數(shù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)因素選取四個(gè)
2、水平,利用L16(43)正交表安排試驗(yàn),以小鼠24h病死率為考察指標(biāo)。觀察小鼠血清ALT、肝組織學(xué)改變,肝臟細(xì)胞凋亡驗(yàn)證造模效果,確定D-GalN、LPS致小鼠肝衰竭的理想劑量搭配。
2、腹腔注射D-GalN(350mg/kg)/LPS(30μg/kg)制造小鼠急性肝衰竭模型。將雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、治療組及正常對(duì)照組。治療組在肝衰竭造模前96h、72h、48、24H和0H皮下注射重組人G-CSF(250mg/
3、kg體重),對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)皮下注射無(wú)菌生理鹽水0.2ml/只。通過(guò)檢測(cè)比較各組小鼠生存率、不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT水平、肝組織損傷程度證明G-CSF對(duì)急性肝衰竭小鼠保護(hù)作用;采用TUNEL染色方法檢測(cè)小鼠肝組織中細(xì)胞凋亡,明確G-CSF具有減少細(xì)胞凋亡作用。使用Real-timePCR方法觀察肝組織中Bcl-2、Bcl-xlmRNA表達(dá)變化。蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)小鼠肝組織Bcl-2表達(dá),進(jìn)一步探討G-CSF抗凋亡
4、作用機(jī)制。
結(jié)果:
1、經(jīng)方差分析造模中各因素作用主次為:D-GalN劑量>LPS劑量>稀釋倍數(shù),D-GalN劑量為350mg/kg、LPS劑量為30μg/kg、原液稀釋三倍為理想造模條件。經(jīng)檢測(cè)小鼠ALT值、造模后肝組織HE染色以及TUNEL染色證明上述優(yōu)化條件造模后符合急性肝衰竭模型。
2、G-CSF對(duì)D-GalN/LPS所致小鼠急性肝衰竭具有治療作用:G-CSF治療可提高D-GalN/LPS所致小鼠急
5、性肝衰竭生存率,治療組小鼠24小時(shí)生存率為40%,高于對(duì)照組15%(χ2=3.989,P=0.046);造模后6h,治療組小鼠血清ALT水平顯著低于對(duì)照組(681.0±113.2VS1371±210.9t=2.882,P=0.044);HE染色結(jié)果示對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝索解離,肝細(xì)胞崩解、彌漫性大片壞死,殘存肝細(xì)胞腫脹,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。G-CSF治療組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂但仍可辨,可見大量細(xì)胞腫脹,炎細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)彌漫性大片壞
6、死,未見肝索解離,未見大量小葉內(nèi)出血。G-CSF抑制D-GalN/LPS致急性肝衰竭造模小鼠肝細(xì)胞凋亡:造模后6h,肝組織中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),治療組亦低于對(duì)照組(654±64.29VS1155±192.6t=2.467P=0.033);造模后6H經(jīng)G-CSF治療組抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組(4.793±0.900VS2.093±0.733;P=0.017),抗凋亡基因Bcl-xl表達(dá)同為治療組高于對(duì)照組(0.412±0
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