熱休克因子1參與粒細胞集落刺激因子對心臟缺血再灌注保護作用的機制研究.pdf

1、血供再通治療是目前缺血性心臟病的主要治療手段。在血供再通治療中缺血再灌注損傷是普遍存在的病理變化。它涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等環(huán)節(jié),嚴重影響了血供再通治療的效果。如何在冠脈血運重建治療中保護心臟,避免缺血再灌注損傷已經(jīng)成為心血管研究領(lǐng)域的熱點之一。
　　目前這個領(lǐng)域中一個主要的研究方向是利用預(yù)處理的方法喚起心臟內(nèi)在的保護信號通路。預(yù)處理的主要方法包括缺血前處理和缺血后處理,但是它們各自的特點限制了臨床上的應(yīng)用。利用藥物模擬預(yù)處理對心

2、肌的保護機制是另一種積極的探索,其中粒細胞集落刺激因子(Granulocytbcolony-stimulatingfactor,G-CSF)是主要候選藥物之一。然而,G-CSF臨床試驗結(jié)果的不一致提示復(fù)雜的臨床背景可能影響了G-CSF對心臟的保護效果,因此對G-CSF在病理環(huán)境下的作用機制進行更加深入的研究尤其重要。
　　熱休克因子1(HeatShockFactor1,HSF1)及其調(diào)節(jié)的熱休克反應(yīng)是機體對抗各種損傷的重要內(nèi)在保護

3、機制。HSF1可以激活多種熱休克蛋白,它們具有多種功能,可以充當(dāng)分子伴侶,幫助蛋白折疊、轉(zhuǎn)運,在生長、發(fā)育、炎癥等多種病理生理過程中都發(fā)揮了重要作用。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)HSF1在心臟缺血再灌注損傷中可以發(fā)揮抗凋亡、抗炎癥、增加心肌舒縮能力等多種作用。同時,在各種不同的病理狀態(tài)下,或是各種臨床藥物的干預(yù)下,HSF1的表達水平和活性狀態(tài)都會發(fā)生變化。
　　目前G-CSF對心臟的預(yù)處理保護機制主要集中在活化內(nèi)源性的保護激酶。作為一

4、種重要的內(nèi)源保護性因子,HSF1是否參與了G-CSF對心臟的保護作用,還有待進一步闡明。這在很大程度上有助于揭示G-CSF在臨床應(yīng)用中效果不一致的原因,并更深入的理解G-CSF對心臟保護作用的機制。
　　第一部分
　　心臟缺血再灌注損傷中HSF1是G-CSF保護作用重要的信號分子
　　假設(shè):粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過激活心臟內(nèi)的保護激酶在缺血再灌注損傷中保護心臟。熱休克因子1(HSF1)是心臟缺血再灌注損

5、傷中重要的內(nèi)在保護因子,有可能也參與了G-CSF對心臟的保護作用。
　　目的:本部分實驗是為了研究HSF1是否參與了G-CSF對心臟缺血再灌注損傷的保護機制。
　　方法:(1)以同窩的野生型小鼠做對照,在HSF1基因敲除小鼠上連續(xù)3天皮下給予G-CSF(100μg/kg/day),然后通過結(jié)扎冠狀動脈前降支,缺血30分鐘后再灌注24小時。通過超聲、血流動力學(xué)和組織染色的方法,評價心功能和心臟梗死范圍。(2)在原代培養(yǎng)心肌細胞

6、給予G-CSF,并將HSF1的siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞,經(jīng)由過氧化氫刺激24小時,通過AnnexinV染色,觀察G-CSF減少心肌細胞凋亡的情況,并比較HSF1siRNA干擾后是否影響G-CSF對心肌細胞的保護作用。
　　結(jié)果:(1)在野生型小鼠中,給予G-CSF能夠明顯改善心功能,降低梗死面積;而在HSF1敲除小鼠中,G-CSF對心臟的保護作用消失。(2)在未進行HSF1RNA干擾的心肌細胞中,給予G-CSF能夠顯著減少過氧化氫誘

7、導(dǎo)的凋亡;而當(dāng)HSF1表達水平下降后(RNA干擾組),G-CSF不能減少心肌細胞的凋亡。
　　結(jié)論:HSF1參與了G-CSF對缺血再灌注損傷中心臟的保護作用并發(fā)揮了重要作用。
　　第二部分
　　HSF1/STAT3是G-CSF對缺血再灌注損傷心臟保護作用的重要信號通路
　　假設(shè):粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過Jak2/STA3信號通路減少缺血再灌注對心臟的損害。熱休克因子1(HSF1)是心臟的內(nèi)在保護因

8、子之一,有可能與STAT家族相互作用。
　　目的:研究心臟缺血再灌注損傷中,G-CSF的保護作用是否與HSF1和STAT3的相互作用相關(guān)。
　　方法:(1)在心臟體外灌流模型和培養(yǎng)的心肌細胞中檢測HSF1表達水平和活性與施加G-CSF的關(guān)系。(2)在乳鼠心肌細胞中觀察G-CSF對STAT3磷酸化的作用。(3)在抑制STAT3活性的情況下,觀察G-CSF對HSF1的作用是否發(fā)生變化。(4)分別在降低HSF1表達水平和抑制HSF

9、1活性的情況下,觀察G-CSF對STAT3的活化是否改變。(5)通過免疫共沉淀技術(shù),觀察HSF1和STAT3的相互作用。
　　結(jié)果:(1)在體外灌流心臟中,缺血再灌注損傷和G-CSF處理并不改變HSF1的轉(zhuǎn)錄水平;利用G-CSF處理乳鼠心肌細胞,HSF1mRNA水平并不隨時間變化而變化,但是可以增加HSF1的磷酸化(Ser230)水平,進而促進熱休克蛋白(HSP)的生成。(2)G-CSF可以活化心肌細胞中的STAT3,并呈現(xiàn)時間依

10、賴性。(3)用S3I-201抑制STAT3的活性后,G-CSF對HSF1的活化明顯被削弱。(4)分別采用RNA干擾HSF1和用KNK437抑制HSF1的方法,觀察到G-CSF對STAT3的激活明顯減弱。(5)進一步的免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),HSF1和STAT3存在相互作用,G-CSF處理后兩者結(jié)合增加,這種變化可以被各自的抑制劑所抑制。
　　結(jié)論:G-CSF在缺血再灌注損傷中并不改變HSF1的表達水平,而是通過提高HSF1活性的方式增