5-HTT與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡在左向右分流肺動(dòng)脈高壓大鼠中關(guān)系的研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(PAH)是指以肺動(dòng)脈壓、肺血管阻力進(jìn)行性增高，終末期導(dǎo)致患者右心衰竭及死亡為特征的一種疾病。肺動(dòng)脈高壓通過復(fù)雜的病理機(jī)制，導(dǎo)致患者在肺組織結(jié)構(gòu)、分子信號(hào)途徑和基因表達(dá)等多個(gè)方面均發(fā)生了異常。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺動(dòng)脈高壓是在炎癥、異常血流剪切力、缺氧等因素的誘發(fā)下，細(xì)胞因子及血管活性物質(zhì)異常產(chǎn)生，并作用于血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮等靶細(xì)胞，導(dǎo)致肺血管異常收縮、生長和重構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)堆積等一系列后果，最終形成肺動(dòng)脈高壓，其中肺血管重構(gòu)

2、是肺動(dòng)脈高壓主要的病理學(xué)特征。
　　研究表明，細(xì)胞的異常增殖，凋亡減少是組織構(gòu)型重建的重要原因之一。凋亡是有核細(xì)胞在某些生理或病理情況下，基因特定程序被啟動(dòng)，通過DNA內(nèi)切酶發(fā)生有序的主動(dòng)性非炎癥性死亡，又稱細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡和增殖是矛盾的兩個(gè)對(duì)立面，它們之間的平衡維持著機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的正常狀態(tài)和生理功能。越來越多的研究證明，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖增加和/或凋亡減少都可促進(jìn)肺血管中膜肥厚和血管構(gòu)型重建，是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的一個(gè)重要

3、機(jī)制。正常情況下，血管壁結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的，由相應(yīng)細(xì)胞的增殖和凋亡共同協(xié)調(diào)維持，當(dāng)血管壁在各種內(nèi)因和外因（如細(xì)胞因子、缺氧、血流剪切力等）的刺激作用下，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，啟動(dòng)內(nèi)部增殖基因和/或凋亡抑制基因的表達(dá)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖增多和/或凋亡減少，促使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、肥大、遷移，最終引起肺血管壁增厚和肺血管重構(gòu)。目前，很多學(xué)者把抗肺血管重構(gòu)的目光轉(zhuǎn)移到促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡這個(gè)靶點(diǎn)上，促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑

4、肌細(xì)胞凋亡可能成為未來治療肺動(dòng)脈高壓的突破口。
　　5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（5-HTT）是一種膜蛋白，表達(dá)于神經(jīng)元、血小板、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞等體細(xì)胞中，主要功能是將5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。5-羥色胺可經(jīng)細(xì)胞膜上的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)進(jìn)入肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，并通過多條促增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖肥大，導(dǎo)致肺血管構(gòu)型重建。研究結(jié)果表明5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體在許多類型的肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中起重要作用，但在左向

5、右分流型肺動(dòng)脈高壓中，是否也存在5-HTT的高表達(dá)，它與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡狀況有無關(guān)系，目前尚未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。
　　他汀類藥物是一種3-羥基，3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，它所具有的降脂、穩(wěn)定粥樣斑塊、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制血小板聚集、抗炎抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用使其廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病等領(lǐng)域。近來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注他汀類藥物的“非調(diào)脂作用”，國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可通過與肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)

6、生作用，降低肺動(dòng)脈壓力，緩解肺血管過度收縮，抑制肺血管重建，他汀類藥物的這些作用可能與誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，用于治療和預(yù)防肺動(dòng)脈高壓有相當(dāng)廣闊的前景。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是一種新型羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是他汀類藥物家族的新成員，其在肺動(dòng)脈高壓中的作用及機(jī)制報(bào)導(dǎo)甚少，更未見其對(duì)高肺血流性肺動(dòng)脈高壓影響的研究。
　　在本研究中，我們用腹腔分流法建立左向右分流大鼠肺動(dòng)脈

7、高壓模型，通過觀察模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞5-HTT的表達(dá)情況及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況，了解大鼠肺高血流肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生是否與這些因素有關(guān)，初步探討肺高血流肺動(dòng)脈高壓可能的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，我們通過瑞舒伐他汀來干預(yù)肺高血流肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，以觀察瑞舒伐他汀是否對(duì)肺高血流大鼠肺組織中5-HTT的表達(dá)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生影響，初步探討瑞舒伐他汀在肺高血流模型大鼠肺血管重構(gòu)中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.將40只SD

8、大鼠隨機(jī)分為4組:①分流11周組、②分流8周組、③分流4周組、④對(duì)照組，每組各10只。分流11周組、分流8周組和分流4周組采用腹主動(dòng)脈，下腔靜脈分流法建立左向右分流大鼠模型，而對(duì)照組開腹但不建立分流。
　　2.在相應(yīng)時(shí)間內(nèi)處死大鼠，處死前測(cè)量大鼠肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)，處死后對(duì)大鼠右心室和左心室+室間隔進(jìn)行稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVI)。
　　3.常規(guī)石蠟包埋大鼠肺組織，切片并HE染色，觀察各組大鼠肺組織小動(dòng)脈的形態(tài)變

9、化，計(jì)算管壁厚度占外徑的百分比(WT％)及管壁面積占血管總面積的百分比(WA％)以此作為反映大鼠肺組織血管重構(gòu)程度的指標(biāo)。
　　4.用免疫組化SP法（鏈霉卵白素-過氧化物酶法）檢測(cè)大鼠肺組織中5-HTT的表達(dá)情況。
　　5.用原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞百分比(AI值)。
　　6.用Western Blot法檢測(cè)各組大鼠肺組織中5-HTT，bcl-2蛋白的水平。

10、
　　7.用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織中5-HTTmRNA的表達(dá)情況。
　　8.在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，另將30只SD大鼠隨機(jī)分為3組（每組10只）:①分流組;②分流給藥組:分流手術(shù)后第二天開始給予瑞舒伐他汀(10 mg/kg)灌胃，每日1次，連續(xù)11周;③對(duì)照組。觀察瑞舒伐他汀對(duì)高肺血流肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺組織中5-HTT、bcl-2蛋白表達(dá)(Western Blot法)及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡(TUNEL法)的影響。

11、>　　9.所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以mean士SD表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，p＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.隨著分流時(shí)間的延長，分流各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓、右心室肥厚指數(shù)(RVI)逐步升高，第11周模型大鼠出現(xiàn)明顯肺動(dòng)脈壓力升高和右心室肥厚的表現(xiàn)，與其他各組間上述指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.隨著分流時(shí)間的

12、延長，分流各組大鼠肺組織血管壁明顯增厚，出現(xiàn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞肥大、增生、管腔狹窄，模型大鼠出現(xiàn)了明顯的肺血管構(gòu)型重建。同時(shí)，各分流組肺小動(dòng)脈管壁厚度占血管外徑百分比(WT％)、肺小動(dòng)脈管壁面積占血管總面積百分比(WA％)也逐步升高，各組之間WT％、WA％值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示隨著分流時(shí)間的延長，各組大鼠肺組織中5-HTT的表達(dá)呈逐步升高的趨勢(shì)，各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。<

13、br>　　4.原位末端標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果提示各組大鼠肺組織內(nèi)均存在一定比例的凋亡肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。隨著分流時(shí)間的延長，大鼠肺動(dòng)脈平滑肌凋亡細(xì)胞逐步減少，凋亡指數(shù)(AI)也逐步下降。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。
　　5.Western Blot法檢測(cè)結(jié)果提示隨著分流時(shí)間的延長，各組大鼠肺組織中5-HTT蛋白、bcl-2蛋白的水平呈逐步升高的趨勢(shì)，分流11周組與其他各組間指標(biāo)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

14、r>　　6.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示隨著分流時(shí)間的延長，各組大鼠肺組織中5-HTTmRNA表達(dá)水平呈逐步升高的趨勢(shì)，其中分流11周組最為明顯，與其他各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.隨著分流時(shí)間的延長，各組大鼠肺組織中5-HTT水平逐步升高，而凋亡指數(shù)(AI)逐步下降，相關(guān)性分析提示5-HTT水平與AI值之間呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)。
　　8.瑞舒伐他汀干預(yù)組大鼠肺組織中5-HTT、bcl-2蛋白

15、水平較分流組明顯降低，而干預(yù)組大鼠肺動(dòng)脈平滑肌TUNEL陽性細(xì)胞百分比較分流組明顯升高，統(tǒng)計(jì)分析顯示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.腹腔分流法能使模型大鼠出現(xiàn)肺動(dòng)脈壓明顯升高、右心室肥厚、肺血管構(gòu)型重建等肺動(dòng)脈高壓的病理改變。
　　2.左向右分流大鼠肺高壓模型中存在著分流時(shí)間依賴的5-HTT、bcl-2蛋白高表達(dá)，而肺動(dòng)脈平滑肌凋亡細(xì)胞百分比卻低于正常水平，5-HTT介導(dǎo)的5-HT信號(hào)通路