環(huán)氧化酶-2-前列腺素E-,2-在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細胞表達細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子中的作用.pdf

1、研究背景及目的
　　 AngⅡ是腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中重要的活性肽,其在體內(nèi)的作用相當廣泛,不論是在循環(huán)中的單核細胞中,還是在動脈粥樣斑塊的巨噬細胞中都有AnglI表達,免疫組化顯示血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACEI)與AngⅡ、血管緊張素I受體(AT1R)在人的冠狀動脈粥硬化斑塊中共表達。諸多實驗證明RAS無論是在早期還是在晚期,無論是其短暫性升高還是持續(xù)性刺激都有促進粥樣硬化的作用。AngⅡ與粥樣斑塊的發(fā)生及發(fā)展上有著密切

2、的聯(lián)系。另有研究證明AngII可誘導巨噬細胞中的MMPs的分泌,這表明了AngⅡ在調(diào)節(jié)斑塊穩(wěn)定中也起著重要的作用。
　　 動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病,炎癥因子在粥樣斑塊形成、發(fā)展及破裂方面的詳細機制一直是研究的熱點。已有多項研究顯示炎癥細胞及因子在斑塊的性質(zhì)及穩(wěn)定性上占有舉足輕重的地位。Cipollone及其同事的近幾年綜述闡述粥樣斑塊中的環(huán)氧化酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)在ACS的發(fā)生、發(fā)展上起著非常重要

3、的作用,作為炎癥因子之一的COX-2/PGE2及其信號途徑,不但參與了體內(nèi)廣泛的炎癥反應(yīng)過程,而且在早期的斑塊形成及晚期的斑塊破裂上也有著重要的作用,抑制COX-2及其下游的前列腺素E合成酶后可起穩(wěn)定斑塊的作用。Cipollone的進一步研究發(fā)現(xiàn),COX-2、巨噬細胞及AngⅡ在斑塊的肩部共染且AngⅡ可通過AT1/COX-2/mPGES-1途徑促進MMPs的表達。這些說明COX-2/PGE2的表達對斑塊穩(wěn)定方面有著重要的影響。

4、　　 細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinasesinducer,EMMPRIN)是單次跨膜、高度糖基化的免疫球蛋白家族。其高表達于腫瘤細胞表面,可刺激人成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)而成為研究腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移機制方面的熱點。近年研究發(fā)現(xiàn),EMMPRIN在冠狀動脈粥樣硬化斑塊中,尤其是在易損斑塊的巨噬細胞中有著高

5、表達,且與MMPs的表達區(qū)域基本一致。另外如腫瘤壞死因子、C-反應(yīng)蛋白等炎癥因子亦可引起EMMPRIN的表達增加,這說明EMMPRIN與炎癥因子之間關(guān)系亦很密切。
　　 EMMPRIN是調(diào)節(jié)MMPs的產(chǎn)生及分泌的一個重要因子,MMPs是一類酶活性依賴鈣、鋅離子的蛋白酶超家族,其可分解纖維帽致使斑塊不穩(wěn)定而易致腦卒中急性冠脈綜合癥等后續(xù)事件的發(fā)生。而作為調(diào)節(jié)MMPs的一個重要因子EMMPRIN,其在易損斑塊的巨噬細胞富含區(qū)也有著高

6、表達,且EMMPRIN、MMPs與巨噬細胞共定位于粥樣斑塊中,體內(nèi)、外實驗,亦證明在EMMPRIN在細胞內(nèi)的表達改變后,MMPs的表達亦會隨著EMMPRIN的改變而改變。在心肌梗死發(fā)生時EMMPRIN及MMP-9都可明顯增高,而當心肌梗死被成功治療后其在血液中的表達水平又可恢復正常,從上述我們可以知道EMMPRIN在調(diào)節(jié)MMPs的表達上有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。此實驗以THP-1巨噬細胞為模型,擬深入探討AngⅡ在THP-1巨噬細胞中對EMM

7、PRIN表達以及調(diào)節(jié)作用:1、AngⅡ可誘導巨噬細胞中COX-2、PGE2、EMMPRIN的表達;2、COX-2、PGE2、EMMPRIN的表達上調(diào)作用是通過AT1受體,AT1受體拮抗劑可抑制該表達,而AT2受體拮抗劑則無該作用;3、證明AngⅡ通過AT1/COX-2/PGE2促進EMMPRIN表達的信號通路存在。
　　 實驗方法
　　 1、人類單核細胞株(THP-1)細胞用完全培養(yǎng)基(含10％的胎牛血清、100U/ml

8、的盤尼西林、100pg/ml的鏈霉素)、37℃下在含95％空氣、5％CO2的孵育箱中培養(yǎng).將細胞數(shù)調(diào)整至1×106 cells/ml移至六孔板中,每孔接種1ml。參照文獻進行最優(yōu)化誘導,加5ng/ml的佛波脂于六孔培養(yǎng)板中,誘導培養(yǎng)48小時后,更換含無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
　　 2、AngⅡ?qū)奘杉毎钚杂绊憸y定:佛波醇誘導后的人類單核細胞株細胞以1×105的數(shù)量接種于96孔板上,每孔加100μl的RPMI-1640培

9、養(yǎng)基,接著以不同濃度(0.01μMto50μM)的AngⅡ?qū)θ祟悊魏思毎暾T導后的巨噬細胞刺激24小時,然后再用加入MTT溶液刺激4小時,對照組則只加入0.1％二甲基亞砜,去除培養(yǎng)基溶于二甲基亞砜中,最后在波長550 nm處測其值。
　　 3、實時RT-PCR:在每孔細胞中加入1mL Trizol,按說明書進行提取,紫外分光光度計測定RNA A260/A280的比值及量。取1μg巨噬細胞的總RNA,根據(jù)RT盒的說明書操作,以O(shè)l

10、igo-dt12進行cDNA的合成.基因COX-2、EMMPRIN、β-actin進行PCR擴增的引物序列分別是:COX-2:上游:5'-GATTGCCCGACTCCCTTGG-3',下游:5'-AAAACTGATGCGTGAAGTGCTG-3':EMMPRIN:上游:5'-GAA TGA CAA AGGCAA GAA CG-3',下游:5'-GAA GGA AGT GTA TGA TGG GAAT-3';β-actin:上游:5'-G

11、TGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3',下游:5'-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3'?；虮磉_用SYBR Green1熒光定量PCR在iQTM5(Bio-Rid,USA)上進行監(jiān)測,結(jié)果用該儀器進行分析。
　　 4、蛋白提取和Western blot:用4℃預冷的RIPA裂解液(含pH7.520 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCI,1％NP-40,0.5％deoxychola

12、te,0.1％SDS,1 mmol/L EDTA,10μg/mL,亮抑蛋白酶肽,2μg/mL胰蛋白酶抑制劑,1 mmol/L苯甲基磺酰氟)裂解細胞,收集裂解的細胞在4℃下,離心半徑為7cm,12000轉(zhuǎn)高速離心10 min,蛋白濃度用Lorry法來測定。取50μg總蛋白樣品,與上樣緩沖液混勻后100℃煮5 min,在10％SDS-PAGE中行垂直電泳(100V,100min),室溫150 mA×90 min轉(zhuǎn)樣品至硝酸纖維素濾膜,5.0

13、％脫脂奶粉在4℃下溫和振蕩封閉3 h。取出膜結(jié)合相應(yīng)的一抗(鼠抗人EMMPRIN單克隆抗體濃度為1∶1000;兔抗人COX-2多克隆抗體濃度為1∶1000),振蕩過夜,TBST洗膜后,結(jié)合相應(yīng)的二抗(兔抗鼠紅色熒光二抗?jié)舛葹?∶5000;羊抗兔綠色熒光二抗為1∶5000),室溫30 min.用Odyssey2.0軟件進行掃描及分析。
　　 5、PGE2的ELISA試劑盒購自中杉金橋生物有限公司,上清中PGE2含量按照PGE2酶聯(lián)

14、免疫測定試劑盒操作說明進行檢測。在酶標監(jiān)測儀上測定450 nm波長的光密度值。
　　 結(jié)果
　　 1、成功建立THP-1巨噬細胞模型
　　 2、AngⅡ?qū)θ祟悊魏思毎昃奘杉毎钚缘臏y定
　　 3、AngⅡ刺激巨噬細胞可增加COX-2和EMMPRIN基因及蛋白的表達
　　 4、AngⅡ刺激后上清中PGE2表達量的測定
　　 5、氯沙坦可阻滯AngⅡ引起的巨噬細胞中COX-2及EMMPRIN

15、的上調(diào)作用
　　 6、AngⅡ通過AT1/COX-2/PGE2途徑誘導巨噬細胞中EMMPRIN表達上調(diào)
　　 結(jié)論
　　 1、AngⅡ可誘導THP-1巨噬細胞中COX-2、PGE2及EMMPRIN的表達;
　　 2、AngⅡ刺激的THP-1巨噬細胞中EMMPRIN表達的增加通過血管緊張素Ⅰ受體,血管緊張素Ⅰ受體拮抗劑可抑制該刺激作用,而血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑則無該作用。
　　 3、THP-1巨噬細