間日瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)研究.pdf

1、間日瘧(Vivaxmalaria)是由間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)引起的周期性發(fā)作的急性傳染病，特點(diǎn)是間隔48小時(shí)反復(fù)發(fā)作。如今已有的抗瘧疾藥物也由于抗藥性瘧原蟲以及耐殺蟲劑傳播蚊的出現(xiàn)而面臨挑戰(zhàn)。制備瘧疾疫苗也就成為了能有效控制瘧疾傳播的主要手段。其中傳播阻斷疫苗(transmission-blockingvaccines，TBVs)是以蚊蟲階段瘧原蟲特異表達(dá)的蟲體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲表面蛋

2、白的特異性抗體。間日瘧傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25是瘧疾研究的主要靶點(diǎn)，其在不同地區(qū)的瘧疾病毒株間具有很高的保守性。
　　Pvs25是在合子以及動(dòng)合子表面表達(dá)的蛋白，分子量為25kDa，含有22個(gè)半胱氨酸形成的11個(gè)二硫鍵，序列含有4個(gè)類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(EGF-likeDomain)。本課題通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Pvs25獲得工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白大量表達(dá);從誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的上清中提取重組蛋白，經(jīng)

3、Ni親和層析純化后，獲得重組蛋白純度達(dá)到95％;將純化后的重組蛋白免疫Balb/c雌鼠制備多克隆抗體;純化后的抗體經(jīng)間接ELISA測定效價(jià)為1∶12800。同時(shí)，利用家蠶生物反應(yīng)器平臺(tái)的Bac-to-Bac系統(tǒng)成功獲得重組桿狀病毒vBm-Pvs25，感染家蠶細(xì)胞、家蠶五齡幼蟲，WesternBlotting分析結(jié)果顯示，目的蛋白表達(dá)成功。構(gòu)建BmCMV-gp64-Pvs25，在載體的多角體啟動(dòng)子前面串聯(lián)一個(gè)CMV啟動(dòng)子序列，這樣表達(dá)的重

4、組蛋白Pvs25不僅可以在BmNPV的表面展示，而且可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)展示。獲得重組桿狀病毒vBmCMV-gp64-Pvs25，用于感染家蠶細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlotting分析、激光共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)目的蛋白成功表達(dá)并展示于質(zhì)膜表面。利用純化得到的vBmCMVgp64-Pvs25病毒粒子免疫Balb/c小鼠獲取抗血清，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行研究，結(jié)果表明其中和效價(jià)為1∶25600，可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。本課