中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病中單核細(xì)胞-星型膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)對(duì)金屬基質(zhì)蛋白酶9基因表達(dá)和分泌的調(diào)控.pdf

1、目的：結(jié)核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病中最常見(jiàn)的疾病，也是死亡率最高的肺外結(jié)核病。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核中，金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)分泌增加，并發(fā)癥和死亡與MMP-9含量有關(guān)。但目前對(duì)結(jié)核桿菌是如何引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織細(xì)胞的MMP-9過(guò)度表達(dá)分泌了解不多。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)核桿菌H37Rv感染人外周血單個(gè)核細(xì)胞后的條件培養(yǎng)基刺激人星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，了解結(jié)核性腦膜炎發(fā)病中腦組織主要細(xì)

2、胞MMP-9的表達(dá)分泌特點(diǎn)，以及腦組織細(xì)胞在調(diào)控MMP-9分泌時(shí)的相互作用，以進(jìn)一步了解結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：六孔板按每孔1.0×106接種U251細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，予結(jié)核分枝桿菌H37Rv按MOI(感染復(fù)數(shù)，即細(xì)菌：細(xì)胞比例)=1、10和100直接感染72h后(M.tb組)，收集細(xì)胞上清，Elisa法檢測(cè)：MMP-9含量，裂解細(xì)胞提取總RNA，RF-PCR檢測(cè)MMP-9基因表達(dá)。密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)

3、核細(xì)胞(PBMCs)后，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋?zhuān)臃N六孔板(1.0×106細(xì)胞/孔)，予結(jié)核分枝桿菌H37Rv按10:1的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h后，收集上清，0.2μm濾膜過(guò)濾除菌獲得條件培養(yǎng)液，其中感染結(jié)核桿菌的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液為CoMTB組(PBMC+1640+H37Rv)，未感染結(jié)核桿菌的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液為CoMCON組(PBMC+1640)，在不含單個(gè)核細(xì)胞的1640中孵育結(jié)核桿菌的培養(yǎng)液為CoTB組(164

4、0+H37Rv)。以上述條件培養(yǎng)液1:5稀釋?zhuān)尤氲?或24孔板星型膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251繼續(xù)培養(yǎng)，ELISA檢測(cè)刺激后12h、24h、48h和72h細(xì)胞上清的MMP-9含量變化，流式細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)上述時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12含量變化；收集共培養(yǎng)后72h的細(xì)胞，提取總RNA，定量RT-PCR檢測(cè)MMP-9和上述炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)情況；明膠酶譜法檢測(cè)CoMTB組24h、48h

5、、72h和72h CoMCON組、CoTB組MMP-9的活性；Western Blot檢測(cè)CoMTB組12h、24h、48h、72h和72h CoMCON組、CoTB組MMP-9蛋白的表達(dá)；提取0，0.5h，1h，2h和6h CoMCON組和CoMTB組刺激U251細(xì)胞后的胞核蛋白，Western Blot檢測(cè)NF-κd3 p65蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①用結(jié)核桿菌按MOI=1、10和100的比例感染U251細(xì)胞72h后，

6、Elisa法和RT-PCR均未檢測(cè)到MMP-9分泌和表達(dá)。②ELISA結(jié)果顯示CoMTB組MMP-9明顯升高，12h開(kāi)始升高(400.1±12.6pg/ml)，24h顯著升高(1750.5±120.9pg/m1)，此后持續(xù)生升高至72h(2900.3±108.4pg/m1)，刺激時(shí)間越長(zhǎng)，濃度越高，而72h CoMCON組和CoTB組MMP-9濃度分別為(70.6±10.4pg/ml、135.6±12.8pg/ml)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義(P<0.01)。③TNF-α、IL-1β在CoMCON組未檢測(cè)到，在CoTB組含量較低(72h分別為114.0±11.7pg/ml、1459.2±221.3pg/ml)，CoMTB組升高最明顯(72h分別為330.8±35.7pg/ml、3165.4±453.2pg/m1)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IL-6、IL-8、IL-12在三組上清中均能檢測(cè)到，但以CoMTB組升高最明顯(72h分別為1789.6±278.4pg

8、/ml、4311.7±565.4pg/ml、702.7±102.9pg/m1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-10三組均未見(jiàn)升高(均<3.0pg/m1)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。④RT-PCR檢測(cè)MMP-9發(fā)現(xiàn)僅在CoMTB組表達(dá)，CoMCON、CoTB二組均未表達(dá)，在CoMCON組中，TNF-a、IL-1β未表達(dá)，在CoTB組中低表達(dá)(相對(duì)含量0.123±0.08、0.544±0.134)，而在CoMTB組高表達(dá)(相對(duì)含量0.487±

9、0.119、0.891±0.222)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-6、IL-8、IL-12在三組中均表達(dá)，但以CoMTB組表達(dá)最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三組中使用IL-10引物均不能通過(guò)PCR方法檢出條帶，提示可能IL-10的含量很少。⑤明膠酶譜法結(jié)果顯示CoMTB組24h、48h和72h上清均可見(jiàn)一大小為92KDa的空白透亮條帶，與染成藍(lán)色的明膠背景對(duì)比，且隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，MMP-9活性增加，而72h CoMCON和COTB組未見(jiàn)條帶。

10、⑥Western-Blot可檢測(cè)到CoMTB組24h、48h、72h細(xì)胞上清中MMP-9蛋白表達(dá)，而CoMCON和CoTB組未檢測(cè)到。⑦Western-Blot檢測(cè)核蛋白NF-κB p65水平，結(jié)果顯示CoMTB組刺激30min后，星型膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)開(kāi)始增加，與CoMCON組相比，1h后增加2倍(P<0.05)，2h時(shí)增加5倍(P<0.01)，并持續(xù)升高至6h。
　　 結(jié)論：結(jié)核桿菌直接刺激人星型膠質(zhì)瘤系U251

11、細(xì)胞不能引起MMP-9的分泌和基因表達(dá)；而結(jié)核桿菌感染外周血單個(gè)核細(xì)胞后的條件培養(yǎng)基(CoMTB組)刺激U251細(xì)胞后能分泌MMP-9，且刺激時(shí)間越長(zhǎng)，含量越高；不含單個(gè)核細(xì)胞的結(jié)核桿菌條件培養(yǎng)基(CoTB組)和未感染結(jié)核桿菌的單個(gè)核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CoMCON組)刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞也不會(huì)引起MMP-9分泌；CoMTB組顯著引起炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的升高，而抑炎因子IL-10并不升高，并能增加