再生蛋白Ⅰα(RegIα)在胃癌發(fā)病中的作用及調(diào)控.pdf

1、胃癌是目前世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率列居我國(guó)第二位。早在90年代Correa提出了經(jīng)典的腸型胃癌演變模式，胃癌可以由胃癌前狀態(tài)如萎縮性胃炎、腸上皮化生及不典型增生（上皮內(nèi)瘤樣變）演變而來(lái)，也有研究發(fā)現(xiàn)胃癌可能直接起源于骨髓的干細(xì)胞。而長(zhǎng)期的炎癥刺激下微環(huán)境的改變可以促進(jìn)甚至導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。據(jù)此我們提出了新的胃癌形成假說(shuō)——“胃粘膜長(zhǎng)期的炎癥導(dǎo)致胃粘膜深層定向干細(xì)胞的破壞，炎癥因子趨使下骨髓干細(xì)胞在損傷部位定植，增殖修復(fù)

2、，而胃粘膜的炎癥免疫反應(yīng)的持續(xù)存在致使局部生物微環(huán)境改變，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)的腺體發(fā)生化生性修復(fù)，在這種持續(xù)的局部生物微環(huán)境作用下，抑癌基因失活，癌基因活化并產(chǎn)生相關(guān)因子和功能蛋白，這些因素作用下腺體細(xì)胞發(fā)生異型增殖、組織浸潤(rùn)導(dǎo)致癌的發(fā)生”。因此，明確從慢性胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素，并對(duì)胃癌前病變階段進(jìn)行干預(yù)阻斷成為胃癌防治和研究的重要方向。已有研究發(fā)現(xiàn)胃粘膜炎癥損害后的修復(fù)再生過(guò)程涉及表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth f

3、actor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多種生長(zhǎng)因子的共同參與，而這些重要因子的過(guò)量表達(dá)又與胃癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。除了這些確定的因子，導(dǎo)致癌變發(fā)生還有新的生長(zhǎng)因子嗎？其作用機(jī)制又是什么？相關(guān)研究已成為胃癌的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 再生蛋白Ⅰ（Regenara T

4、iO2 gene I，RegI）是Terazono等首先從再生的鼠胰島中檢測(cè)并分離出來(lái)的能夠促胰腺細(xì)胞再生的生長(zhǎng)因子。人類RegIα是由166個(gè)氨基酸組成的含信號(hào)肽的蛋白質(zhì)。其后研究發(fā)現(xiàn)在胃粘膜中也存在Reg蛋白的表達(dá)，其中RegIα是胃粘膜中最主要的Reg家族成員，在胃粘膜的修復(fù)中起到重要的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染的患者和蒙古沙鼠胃粘膜中RegIα的表達(dá)水平升高；也有報(bào)道

5、發(fā)現(xiàn)一些胃癌組織中存在RegIα的表達(dá)；而RegI轉(zhuǎn)基因小鼠的胃底粘膜腺體明顯增厚，促進(jìn)胃腺體粘液頸細(xì)胞(Mucosa NeckCell，MNC)的增殖和分化，提示其可能是胃腺體干細(xì)胞樣細(xì)胞所在區(qū)域的重要調(diào)節(jié)因素，可能與胃炎癌變有關(guān)。因此系統(tǒng)地對(duì)慢性胃炎、胃癌前病變、胃癌中的RegIα作研究意義極大。
　　 1.材料方法：
　　 1.1不同病理狀態(tài)的胃粘膜組織和胃癌細(xì)胞Reglα的表達(dá)檢測(cè)
　　 收集胃粘膜活動(dòng)性

6、炎癥、腸化、不典型增生及大致正常胃鏡活檢標(biāo)本，并選取醫(yī)院組織庫(kù)收集的行胃癌切除手術(shù)的胃癌組織標(biāo)本。用SYBR-Green熒光半定量PCR的方法檢測(cè)不同病理狀態(tài)下胃粘膜組織RegIα mRNA的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)6株不同分化程度的胃癌細(xì)胞RegIα的mRNA表達(dá)。
　　 1.2建立RegIα cDNA高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株，觀察癌細(xì)胞的增殖和凋亡
　　 構(gòu)建高表達(dá)RegIα cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-RegIα-EG

7、FP質(zhì)粒，并以空質(zhì)粒pIRES2-EGFP為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染至MKN28細(xì)胞株，并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。MTT法分別測(cè)定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在O、24、48、72、96小時(shí)的細(xì)胞活力。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的MKN28細(xì)胞中分別加入含0、100、200、800μmol/L的H2O2培養(yǎng)液，培養(yǎng)2小時(shí)、6小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞測(cè)定200μmol/L的H2O2處理6小時(shí)后細(xì)胞的凋亡情況及western blot檢測(cè)Bad、Bcl-xL和Caspa

8、se3的表達(dá)。
　　 1.3建立慢性活動(dòng)性胃炎大鼠模型，觀察胃泌素與胃粘膜RegIα的變化
　　 雄性Wister大鼠20只，分為對(duì)照組和模型組，模型組以2％水楊酸鈉和30％酒精的混合液、20mmol/L的去氧膽酸鈉2ml灌胃，0.1％氨水自由飲用，結(jié)合饑餓飽餐因素，共10周成模。對(duì)照組給予生理鹽水2ml灌胃。成模后以4％的水合氯醛lml/100g腹腔注射麻醉，留取股動(dòng)脈血3ml，留取血清及大鼠胃粘膜組織，H&E鑒定病理

9、，免疫組化檢測(cè)腺體增殖區(qū)PCNA和GSⅡ表達(dá)。ELISA方法檢測(cè)大鼠血清胃泌素的水平，以SYBR-Green熒光半定量PCR的方法分別檢測(cè)胃粘膜RegI、RegR的mRNA，Western blot的方法檢測(cè)RegI蛋白的表達(dá)水平。
　　 1.4 RegIα調(diào)控相關(guān)機(jī)制研究
　　 以O(shè)、10-8、10-7、10-6mmol/L的Gastrinl7(G17)刺激AGS細(xì)胞并用MTS法測(cè)定細(xì)胞活力。分別測(cè)定10-7mmol/

10、L的G17刺激后細(xì)胞Reglα的mRNA表達(dá)。將AGS細(xì)胞種分別予0、10-7、10-6mmol/L的G17刺激24、72h，分別提取細(xì)胞的總蛋白、細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，Western blot檢測(cè)總蛋白、細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白的β-catenin的表達(dá)。
　　 2.主要結(jié)果：
　　 2.1與大致正常組(n=25)相比，活動(dòng)性炎癥(n=20)、腸化(n=40)、不典型增生(n=17)中RegIα表達(dá)升高非常明顯(0.6

11、2±0.45/2.68±0.60/2.11±0.42/2.61±0.71；P<0.01，P<0.05)；胃癌組RegIα表達(dá)也升高明顯（2.47±0.53，P<0.01），而且Ⅲ/Ⅳ期的胃癌比Ⅰ期/Ⅱ期的RegIα表達(dá)更高(3.06±0.24/2.98±0.36/1.04±0.24，P<0.01)；在6株胃癌細(xì)胞中，分化程度低的MKN45和AGS細(xì)胞的RegIαmRNA表達(dá)水平增高較其他分化高的細(xì)胞株更明顯，MKN45/AGS/MKN2

12、8/NCI-N87/BGC-823/SGC-7901細(xì)胞株的相對(duì)表達(dá)水平分別為3.24/3.77/-12.61/-3.70/-11.86/-5.39。
　　 2.2成功構(gòu)建了pIRES2-RegIα-EGFP質(zhì)粒，繼而建立了高表達(dá)RegIα cDNA的細(xì)胞株。高表達(dá)RegIα的MKN28細(xì)胞增殖活力較空白對(duì)照組明顯增高（OD值：0.60±0.061/0.51±0.012,P<0.05;0.79±0.041/0.67±0.034,

13、P<0.01），而給予H2O2誘導(dǎo)后，高表達(dá)RegIα的MKN28的細(xì)胞抗凋亡能力明顯增強(qiáng)（OD值：1.73±0.067/1.44±0.131，P<0.01)。經(jīng)western blot檢測(cè)，RegIα高表達(dá)的MKN28細(xì)胞Bad、Caspase3蛋白明顯降低，而B(niǎo)el-xL表達(dá)水平升高。
　　 2.3大鼠模型在建模第10周末處死，經(jīng)病理鑒定，均成功建立慢性炎癥的大鼠模型。模型組大鼠與對(duì)照組相比炎癥評(píng)分明顯升高（P<0.05），

14、而腺體數(shù)目明顯減少（38.8±4.59/44.2±2.57mm?1，P<0.05），但腺體厚度雖有所減少但并無(wú)明顯差異（98.5±24.3/109.1±21.0μm，P>0.05）。模型組大鼠的血清胃泌素較對(duì)照組明顯升高（375.0±103.9/209.6±48.2ng/ml，P<0.01）。免疫組化顯示腺體增殖區(qū)模型組大鼠PCNA和GSⅡ表達(dá)增加。模型組大鼠胃粘膜RegI蛋白表達(dá)明顯升高(0.96±0.12/0.56±0.13，P<0

15、.05)，RegI受體的表達(dá)也明顯升高（0.34±0.31/-0.31±0.22，P<0.05）。
　　 2.4隨G-17刺激濃度增加，AGS細(xì)胞增殖加快，且AGS表達(dá)RegIα mRNA的水平也隨G-17刺激時(shí)間升高，Q-PCR結(jié)果顯示當(dāng)用10-7mol/L G17刺激96小時(shí)后，RegIα mRNA水平升高了4.18倍。隨G-17刺激時(shí)間和刺激濃度增加，細(xì)胞漿的β-catenin表達(dá)逐漸下降，而細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin升

16、高。
　　 3.結(jié)論：
　　 3.1在慢性活動(dòng)性胃炎、胃癌前病變及胃癌中存在RegIα的高表達(dá)，RegIα高表達(dá)是胃粘膜受到病理?yè)p害后現(xiàn)象，可能是參與胃粘膜的修復(fù)的需要，事實(shí)上也可能參與了胃癌前病變胃癌變的過(guò)程，RegIα可能是胃癌發(fā)病調(diào)控過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)因子類物質(zhì)。
　　 3.2 RegIα表達(dá)水平與胃癌分期和癌細(xì)胞的分化程度有關(guān)，并可能通過(guò)Bad/Bcl-xl/Caspase3途徑抑制癌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)癌