腦出血后基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)變化及其在血腦屏障損害中的意義.pdf

1、研究背景:
　　 血腦屏障(Blood-brainbarrier，BBB)主要由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接(Tightjunctions)構(gòu)成，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起決定性作用，其中緊密連接則是維持BBB功能的最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)之一。緊密連接在結(jié)構(gòu)上是由一組蛋白分子元件所構(gòu)成的復(fù)合體，主要由跨膜蛋白claudins蛋白家族、junctionassociatedmolecules(JAMs)蛋白家族、occludin蛋白

2、及胞漿附屬蛋白zonulaoccludens(ZOs)蛋白家族構(gòu)成。細(xì)胞膜上跨膜緊密連接蛋白分子彼此相互作用并與鄰近細(xì)胞膜上緊密連接蛋白相聚合，限制細(xì)胞旁物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。生理?xiàng)l件下，BBB內(nèi)皮細(xì)胞中這些緊密連接蛋白分子的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。當(dāng)由于各種原因，如外傷、感染、缺血缺氧、高熱、腫瘤等，則可能通過多種途徑導(dǎo)致BBB內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接分子元件的表達(dá)、修飾、組裝異常進(jìn)而直接導(dǎo)致BBB的結(jié)構(gòu)、功能障礙。BBB的破壞是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦損害和疾病

3、發(fā)生、發(fā)展的重要原因。
　　 腦出血（Intracerebralhemorrhage，ICH）是一種常見的腦血管疾病，占腦卒中總發(fā)病率的15-20％，是最嚴(yán)重的腦卒中類型，死亡率、致殘率非常高。BBB的破壞是ICH發(fā)生后的一個普遍而重要的病理生理變化。目前認(rèn)為，BBB破壞引起的血管源性腦水腫是ICH后腦水腫的主要類型。在ICH發(fā)生后，血腫周邊腦組織存在BBB緊密連接超微結(jié)構(gòu)的破壞。目前，腦出血后緊密連接異常改變及血腦屏障破壞的具

4、體機(jī)制仍未完全清楚。而緊密連接是由一組不同的緊密連接蛋白分子所構(gòu)成的復(fù)合體，因此闡明ICH后BBB內(nèi)皮細(xì)胞各緊密連接蛋白分子的異常變化及其機(jī)制則是研究ICH等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中腦組織損傷機(jī)制的關(guān)鍵之一。
　　 在緊密連接蛋白表達(dá)變化的分子機(jī)制研究方面，隨著近年來緊密連接基礎(chǔ)研究的深入，目前認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)的表達(dá)與活性變化可能是導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接蛋白分子元件異

5、常變化及BBB破壞的一個重要機(jī)制。MMPs是一類鋅離子依賴性蛋白酶，可降解細(xì)胞外所有基質(zhì)成分，主要參與細(xì)胞間基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管新生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及遷移、胚胎發(fā)育及損傷修復(fù)過程。研究表明，腦出血患者及ICH大鼠模型上可檢測到MMPs表達(dá)增高，并且組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2可減輕ICH大鼠模型的BBB破壞。近年有研究報道，在大鼠局部腦缺血模型中，BBB主要緊密連接蛋白claudin-5、occludin的表達(dá)水平均明顯降低，

6、隨之出現(xiàn)大量的緊密連接蛋白降解產(chǎn)物。這一緊密連接蛋白的異常變化與組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9(MMP-2、9)的表達(dá)水平與活性升高密切相關(guān)。當(dāng)采用MMPs抑制劑BB-1101治療后，則可顯著抑制緊密連接蛋白claudin-5、occludin的破壞過程。
　　 因此，本研究推測:ICH發(fā)生后，血腫及血腫分解產(chǎn)物等物質(zhì)可能通過多種途徑（尤其是MMPs通路）導(dǎo)致血腫周邊腦組織BBB緊密連接蛋白的表達(dá)與分布異常，進(jìn)而產(chǎn)生BBB結(jié)構(gòu)破壞

7、與腦水腫。
　　 目的:
　　 本研究通過采用腦內(nèi)注射自體血制作大鼠ICH模型，檢測不同時間點(diǎn)血腫周邊腦組織MMP-2、9及相關(guān)BBB緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的表達(dá)變化，探究ICH后BBB緊密連接蛋白表達(dá)變化與BBB破壞的關(guān)系，并且進(jìn)一步分析ICH后MMPs的表達(dá)與緊密連接蛋白表達(dá)改變的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組與ICH大鼠模型制作
　　 成年

8、雄性SpragueDawley大鼠128只，重量250～300g，隨機(jī)分為對照組和ICH6h、12h、24h、48h、3d、7d、14d等8個組別，每組16只。左心室采集自體血后，立體定向穿刺右側(cè)尾狀核，注射75μl非抗凝自體動脈血制作大鼠ICH模型。對照組采用正常大鼠。
　　 2、伊文思藍(lán)通透性
　　 大鼠處死前按4ml/kg劑量經(jīng)股靜脈注射2％伊文思藍(lán)生理鹽水溶液，取腦組織進(jìn)行稱重，侵入2ml50％三氯乙酸水溶液中進(jìn)

9、行勻漿，經(jīng)高速離心后與無水酒精按1:3混合，接著在熒光分光光度計上測量伊文思藍(lán)的熒光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各腦組織伊文思藍(lán)濃度，以每克腦組織的伊文思藍(lán)含量(ug/g)來表示。
　　 3、石蠟組織包埋與切片
　　 各組大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，自左心室灌注冰凍生理鹽水及4％多聚甲醛溶液固定。切取厚度約2mm的尾狀核冠狀斷面腦組織，迅速投入4％多聚甲醛固定液中于4℃下固定2天。固定好的腦組織按照常規(guī)石蠟標(biāo)本包埋方法進(jìn)行制作石蠟標(biāo)本，

10、石蠟組織切片機(jī)切片，切片厚度5um。
　　 4、HE染色
　　 石蠟切片脫蠟水合后，經(jīng)蘇木素染色3min，1％伊紅染色2min，中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。
　　 5、免疫組化
　　 免疫組化檢測ICH后MMP-2及MMP-9表達(dá)變化。石蠟切片抗原修復(fù)采用微波爐抗原熱修復(fù)，抗原修復(fù)液為Tris-EDTA緩沖液(0.05MTris-base，0.001MEDTAPH8.0)，微波爐加熱至煮沸后

11、斷電，反復(fù)一次，間隔15min。DAB顯色，中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。
　　 6、免疫熒光
　　 免疫熒光檢測各組緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1的分布與表達(dá)的變化。用鼠抗claudin-5與兔抗GFAP聯(lián)合進(jìn)行熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)及兔抗occludin、兔抗JAM-1進(jìn)行免疫熒光單標(biāo)實(shí)驗(yàn)。用激光共聚焦顯微鏡在高倍視野下拍攝血腫周邊腦組織圖片，分析微小血管上緊密連接蛋白表達(dá)變化。

12、>　　 7、實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)
　　 實(shí)時熒光定量PCR分析claudin-5、occludin、JAM-1表達(dá)變化。RNA提取純化使用GeneJETTMRNA純化試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用Maxima(@)第一鏈cDNA合成試劑盒，具體步驟按照說明書操作。熒光定量PCR采用基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對濃度定量的方法，SYBRGreen熒光方案檢測PCR擴(kuò)增，使用ABIPRISM7500實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行分析。在熒光定量PCR

13、反應(yīng)中取不同梯度模板DNA標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣本的起始模板cDNA相對濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得，經(jīng)內(nèi)參β-actin及對照組校準(zhǔn)后以倍比表示。
　　 8、統(tǒng)計學(xué)方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用ONE-WAY方差分析。方差齊性時多重比較用LSD-t檢驗(yàn);方差不齊時用Welch近似方差分析，多重比較用DunnettT3檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。<

14、br>　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、各組腦組織伊文思藍(lán)含量結(jié)果提示:與正常對照組相比，ICH后24h至7d腦組織伊文思藍(lán)含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中ICH后48h增高最明顯，是正常對照組的2.23倍。
　　 2、通過HE染色觀察不同組別腦組織病理改變來看，ICH后6h及12h未見到血腫周圍區(qū)有明顯腦組織疏松化;ICH后24h時血腫周圍腦組織開始出現(xiàn)明顯的水腫帶;ICH48h:血腫周圍水腫嚴(yán)重廣泛，正常

15、的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少;ICH后3d血腫周圍不但可見到明顯的水腫帶，其顯著的特征是出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，可觀察到大量白細(xì)胞滲出;ICH后7d可見血腫部分吸收，血腫周圍有不太明顯的水腫帶及大量吞噬細(xì)胞;ICH后14d血腫周邊水腫不明顯，血腫未完全吸收，吸收后的血腫區(qū)見較多吞噬細(xì)胞及含鐵血黃素沉積。
　　 3、免疫組化可觀察到ICH后MMP-2及MMP-9可見明顯增高。出血組自6h起血腫周圍腦組織可見強(qiáng)陽性表達(dá)MMP-2的細(xì)胞，其形態(tài)提示

16、為有突起的膠質(zhì)細(xì)胞。ICH48h及3d血腫周邊MMP-2陽性細(xì)胞更顯著，可見血腫周圍小血管被MMP-2陽性細(xì)胞圍繞著，同時內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)不同程度的MMP-2。相應(yīng)的，腦出血后MMP-9表達(dá)也明顯增高?？捎^察到出血組6h～24h血腫邊緣散在少數(shù)細(xì)胞陽性表達(dá)MMP-9，ICH后48h至7d可見到MMP-9表達(dá)明顯增高，主要分布在白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上。
　　 4、ICH后緊密連接蛋白claudin-5表達(dá)明顯降低。共聚焦顯微鏡觀察提示c

17、laudin-5呈線條狀強(qiáng)烈表達(dá)于小血管上。與對照組比較，ICH組自6h起，claudin-5表達(dá)就出現(xiàn)降低，呈不連續(xù)及弱表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞間，48h及3d時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達(dá)最低，7d時稍有恢復(fù)，直到14d基本恢復(fù)正常表達(dá)水平。相應(yīng)的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，claudin-5mRNA表達(dá)在ICH后6h時出現(xiàn)迅速降低至最低水平，維持到7d逐漸恢復(fù)，直至14d仍低于正常水平，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5

18、、ICH后緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)明顯降低。共聚焦顯微鏡觀察提示occludin形態(tài)與claudin-5一致。ICH后6h起occludin呈不連續(xù)及弱表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞間，48h及3d時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達(dá)最低，7d時逐漸恢復(fù)，于14d恢復(fù)至正常表達(dá)水平。相應(yīng)的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，occludinmRNA表達(dá)在6h至3d表達(dá)降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 6、ICH后緊密連接蛋白JAM-1表

19、達(dá)先明顯降低，短期內(nèi)迅速恢復(fù)后出現(xiàn)表達(dá)增高。共聚焦顯微鏡觀察提示，正常腦內(nèi)皮上JAM-1形態(tài)與claudin-5、occludin一致。與對照組比較來看，ICH組自12h起，內(nèi)皮細(xì)胞間JAM-1表達(dá)開始出現(xiàn)降低，呈不連續(xù)或及弱表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞間，24h、48h時其在血腫周圍腦水腫區(qū)域表達(dá)明顯降低。但與claudin-5及occludin不同的是，血管上JAM-1于3d時基本恢復(fù)正常，其表達(dá)較其他時間點(diǎn)更強(qiáng)烈，并表達(dá)在一些炎性細(xì)胞上。7d及

20、14d時血腫周圍可見大量表達(dá)JAM-1的炎性細(xì)胞。相應(yīng)的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組相比較，ICH后12h至48hJAM-1mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，3d時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，ICH后7d其表達(dá)水平出現(xiàn)增高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、ICH后可導(dǎo)致BBB破壞及繼發(fā)性腦水腫發(fā)生，跨膜緊密連接蛋白claudin-5、occludin、JAM-1表