脫落滋養(yǎng)細(xì)胞用于孕早期快速產(chǎn)前診斷的研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的：比較孕早期經(jīng)過(guò)宮頸獲取滋養(yǎng)細(xì)胞的幾種方法，探討適宜的取材方法，并檢驗(yàn)其方法應(yīng)用的敏感性和可靠性。
　　 方法：選取早孕并要求終止妊娠的60名早孕婦女（孕6周～孕10周），在其知情同意后，分別采用3種方法經(jīng)宮頸采集脫落細(xì)胞，隨機(jī)分為三組，每組各20例：A組采用宮頸管棉拭子法，B組采用宮頸內(nèi)口粘液吸引法，C組采用細(xì)胞刷法。選取20名未孕的婦女，在其知情同意后，行宮腔灌洗法采集的宮頸脫落細(xì)胞懸液作為對(duì)照

2、組（D組）。收集后的宮頸脫落細(xì)胞的標(biāo)本，行HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色，然后顯微鏡觀察滋養(yǎng)細(xì)胞的存在情況，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色選用的單克隆抗體細(xì)胞角蛋白-7（CK-7），與滋養(yǎng)細(xì)胞上的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，觀察陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果：1.HE染色法：A組、B組、C組3種方法得到的標(biāo)本中分別有8例（40％）、11例（55％）、18例（90％）標(biāo)本中見滋養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)照組的標(biāo)本中均未見滋養(yǎng)細(xì)胞。A組的滋養(yǎng)細(xì)胞獲得率與B組

3、比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），C組的滋養(yǎng)細(xì)胞獲得率較A組和B組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01，p<0.01）。2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色法：A組、B組、C組3種方法得到的標(biāo)本中分別有2例（10％）、5例（25％）、18例（90％）標(biāo)本中見陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。對(duì)照組的標(biāo)本中均未見陽(yáng)性細(xì)胞。A組的滋養(yǎng)細(xì)胞獲得率與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），C組的滋養(yǎng)細(xì)胞獲得率較A組和B組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01，p<0.01）。3

4、.三種方法采集滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量的比較：(1)HE法：3種方法中細(xì)胞刷法取得的細(xì)胞量最多，分別與宮頸管棉拭子組和宮頸內(nèi)口粘液吸引組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.002，p=0.002）。而宮頸管棉拭子組采集的細(xì)胞的量與宮頸內(nèi)口粘液吸引組相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.605）。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法：三種方法中細(xì)胞刷法取得的細(xì)胞量最多。宮頸管棉拭子組中見陽(yáng)性細(xì)胞的例數(shù)太少，無(wú)法進(jìn)行比較。細(xì)胞刷法取得的滋養(yǎng)細(xì)胞量多于粘液吸引組，比較后

5、其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000）。4.采集標(biāo)本中滋養(yǎng)細(xì)胞的量與采集標(biāo)本的孕周有一定的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)中，孕6周未采集到滋養(yǎng)細(xì)胞，從孕7周到孕10周隨著孕周增加采集的標(biāo)本中獲得的滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量增多（r=0.548，p=0.005）。5.滋養(yǎng)細(xì)胞的陽(yáng)性率與孕婦的妊娠次數(shù)及標(biāo)本的血污程度有一定關(guān)系（p=0.033，p=0.048），與孕婦的年齡和分娩次數(shù)無(wú)相關(guān)性（p=0.122,p=0.228）。
　　 結(jié)論：1.從早孕婦女宮頸管獲取滋

6、養(yǎng)細(xì)胞是可行的。2.經(jīng)宮頸細(xì)胞刷法取得的細(xì)胞量較多，成功率高。所以認(rèn)為細(xì)胞刷法是一種較好的微創(chuàng)取材方法。3.孕7周之后經(jīng)宮頸獲取滋養(yǎng)細(xì)胞的成功率較高，細(xì)胞量較多。
　　 第二部分:
　　 目的：研究熒光原位雜交（FISH）技術(shù)在快速產(chǎn)前診斷胎兒染色體數(shù)目的應(yīng)用，探討其對(duì)宮頸脫落細(xì)胞在產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值：通過(guò)比較兩組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、吻合度和差異性，分析FISH技術(shù)在染色體數(shù)目檢測(cè)中的快速性和準(zhǔn)確性，并分析和常規(guī)染色

7、體核型分析的優(yōu)缺點(diǎn)。
　　 方法：（1）分組：采集的脫落細(xì)胞經(jīng)過(guò)富集和純化后行FISH檢測(cè)，作為實(shí)驗(yàn)組；并同時(shí)取對(duì)應(yīng)孕婦的絨毛組織作為對(duì)照組，行常規(guī)的染色體核型分析。（2）滋養(yǎng)細(xì)胞純化和富集：選取早孕并要求終止妊娠的20名婦女（孕8周～孕10周），應(yīng)用前一部分的取材方法中較好的細(xì)胞刷法無(wú)菌取得的實(shí)驗(yàn)組樣本，在排除精液污染后，經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理去除粘液等步驟后，行差速貼壁法培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，盡可能的純化和富集細(xì)胞。（3）滋養(yǎng)細(xì)胞的鑒定：取

8、出一部分用細(xì)胞角蛋白-7（CK-7）行免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定，并計(jì)數(shù)細(xì)胞量。（4）用FISH技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)：FISH組的樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理、樣本變性、探針變性、雜交及其后處理、熒光顯微鏡觀察等程序。（5）常規(guī)染色體核型分析：對(duì)宮頸脫落細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的孕婦，人工流產(chǎn)時(shí)無(wú)菌操作獲取絨毛，經(jīng)過(guò)絨毛組織細(xì)胞培養(yǎng)的方法，染色體核型分析等步驟得到最后的結(jié)果。
　　 結(jié)果：（1）細(xì)胞刷法所取的20例樣本經(jīng)過(guò)4天的培養(yǎng)后，培養(yǎng)成功的例數(shù)為18例（90％

9、）。培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞在行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定后行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞達(dá)到103個(gè)/ml-104個(gè)/ml。從培養(yǎng)成功的標(biāo)本中取10例行FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示標(biāo)本和探針雜交良好，鏡下觀察見背景暗，熒光信號(hào)明亮清晰，10例均雜交成功。顯示男胎7例，女胎3例，13、18和21號(hào)染色體的數(shù)目均正常。對(duì)照組中相對(duì)應(yīng)的絨毛培養(yǎng)細(xì)胞染色體核型結(jié)果顯示為男胎8例，女胎2例，13、18和21號(hào)染色體的數(shù)目均正常。（2）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的結(jié)果符合率為90％。FISH組每

10、例標(biāo)本耗時(shí)24h，雖然標(biāo)本也需4天的細(xì)胞培養(yǎng)，所需細(xì)胞量還是相對(duì)較少的。通過(guò)差速貼壁法可以盡可能的去除一些母體細(xì)胞，能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)富集滋養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目，達(dá)到產(chǎn)前診斷的目的。絨毛組織一般需經(jīng)歷5-7天的培養(yǎng)才可以收獲細(xì)胞。
　　 (3)應(yīng)用國(guó)產(chǎn)探針進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)的過(guò)程中，適當(dāng)?shù)母淖兲结樀淖冃詼囟燃拔傅鞍酌傅南瘯r(shí)間，并將之前用甲酰胺變性標(biāo)本和洗滌標(biāo)本的過(guò)程省去，因?yàn)榧柞０芬讚]發(fā)并具有一定的致癌作用，在適度的修改步驟后，也能得出