復(fù)合環(huán)孢素A的同種異體骨與凍干骨、同系骨骨誘導(dǎo)性及免疫原性的比較.pdf

1、研究背景：
　　 長期以來,臨床上的骨缺損修復(fù),特別是大段骨缺損的修復(fù),一直是外科醫(yī)生面臨的難題之一。解決方法主要有骨移植術(shù)及骨痂延長術(shù)。其中用于骨移植的材料主要有自體骨、同種異體骨、異種骨及人工骨四類。自體骨骨生成能力強(qiáng)、無免疫排斥等優(yōu)點(diǎn),但在骨缺損治療過程中,自體骨具有明顯的局限性和并發(fā)癥n’,如來源有限、對供區(qū)有損傷、機(jī)會感染等,這些不利因素限制了其在臨床上的應(yīng)用；人工骨雖然傳導(dǎo)性較好但骨誘導(dǎo)性較差[2]、缺乏孔隙、顆粒較

2、小、易分解、脆性大不耐壓且相對缺乏生物活性等缺點(diǎn),限制了它的應(yīng)用。而同種異體骨自1880年Macewe[3]做了人類歷史上首例同種異體骨移植術(shù),1908年Lexer最早實(shí)施了膝關(guān)節(jié)腫瘤切除后的同種異體骨移植術(shù),1915年Albee出版了《骨移植外科》以來,同種異體骨移植逐漸成為骨科治療的重要手段,它取材方便,數(shù)量形狀不受限制,對已被破壞的骨折周圍的內(nèi)環(huán)境,有著恢復(fù)迅速、改善和重建血循環(huán)快捷并且其成骨性能及力學(xué)性能優(yōu)于人工骨,而來源也不像

3、自體骨那樣受到限制等,諸多獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用價值,進(jìn)而使得同種異體骨在臨床上應(yīng)用廣泛[4-6],逐漸成為骨科治療的重要手段[7]。但也存在一些目前難以徹底解決的問題,如免疫排斥、晚期感染、移植骨愈合緩慢等,同種異體骨移植愈合受它的生物機(jī)制和免疫機(jī)制兩大原則支配,而免疫排斥反應(yīng)是它的關(guān)鍵；免疫排斥反應(yīng)的主要表現(xiàn)為異體骨周圍炎癥細(xì)胞浸潤,再生血管變性閉塞,造成骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)作用下降及廣泛的骨吸收,引起骨延遲愈合、不愈合、骨質(zhì)疏松、骨折等；異體

4、骨是異體生物性材料,具有一定的免疫抗原性,免疫排斥反應(yīng)是制約異體骨移植的主要因素。降低異體骨移植的免疫排斥反應(yīng)是提高治療效果和決定異體植骨成功與否的關(guān)鍵。早期異體骨移植的最大問題是疾病傳播與免疫排斥反應(yīng)[6],而移植排斥反應(yīng)仍是導(dǎo)致新鮮同種異體骨移植失敗的最主要因?yàn)閇7,8]。機(jī)體的免疫系統(tǒng)對于植入體內(nèi)的非已成分(同種異體骨)會產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答的防御行為,其中包括炎癥反應(yīng)、抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體活化及各種細(xì)胞因子的表達(dá)等,因此在生物材料和醫(yī)療

5、器械的生物學(xué)評價中引入免疫學(xué)評價的內(nèi)容將對減小人體應(yīng)用的風(fēng)險提供必要的科學(xué)依據(jù),同種異體骨是骨科最常用的骨植入材料之一[9],同時異體骨的免疫原性與異體骨移植修復(fù)骨缺損的臨床效果密切相關(guān)陽[9-11]。
　　 早些時候人們曾嘗試著用柳硫汞等化學(xué)方法的處理來降低異體骨的免疫原性和對其進(jìn)行滅菌,但效果不佳。隨著制備工藝的改進(jìn),人們逐漸傾向于用深低溫冷凍法、冷凍干燥法及γ射線輻照來降低異體骨的免疫原性,其中γ射線輻照更兼具強(qiáng)大的滅菌功

6、效[12]。經(jīng)過世界各國骨庫幾十年來的實(shí)踐證明,上述方法能夠很好地降低異體骨的免疫原性并有效地降低了因骨移植所致的疾病傳播的風(fēng)險,因而是目前最為常用的同種異體骨的制備方法。然而嚴(yán)格地講,上述方法并不能完全消除同種異體骨的免疫原性,而經(jīng)過上述方法處理后,同種異體骨的成骨性能及生物力學(xué)性能受到了明顯的損害[13,14]。致使目前為止臨床上應(yīng)用異體骨修復(fù)骨缺損的效果,特別是修復(fù)大段骨缺損的效果仍不能夠令人滿意。鑒于此本課題組對同種異體骨的制備

7、方法進(jìn)行新的探索。具體而言,就是在制備同種異體骨的過程中復(fù)合環(huán)孢菌素,通過在局部發(fā)揮環(huán)孢菌素強(qiáng)大的免疫抑制作用來代替深低溫冷凍、冷凍干燥及γ射線輻照的降免疫原性作用,并用低溫等離子體技術(shù)來代替γ射線輻照對異體骨進(jìn)行滅菌,以期更好地抑制異體骨移植的免疫排斥反應(yīng),同時減輕制備過程中對異體骨成骨性能及力學(xué)性能的損害。另外,我們希望通過環(huán)孢菌素的局部應(yīng)用來降低其藥物副反應(yīng)。
　　 研究目的：
　　 為了進(jìn)一步減輕同種異體骨的免疫

8、原性,同時又不損害異體骨的機(jī)械強(qiáng)度,裴國獻(xiàn)、陸海波等人采用新的方法制備了復(fù)合環(huán)孢素A的同種異體骨,并申請到了發(fā)明專利。在同種異體骨治療大段骨缺損方面進(jìn)行了有益的探索。但復(fù)合環(huán)孢素同種異體骨在制備過程中需要對供骨進(jìn)行脫脂脫蛋白,一定程度上減輕了其免疫原性,但同時也造成了對同種異體骨生物學(xué)特性起重要作用的BMP及其他生物活性成分的大量丟失。因此有必要對其免疫原性及骨誘導(dǎo)性進(jìn)行評估,通過對復(fù)合環(huán)孢素A并低溫等離子體滅菌這一新的異體骨制備方法制

9、備的同種異體骨與凍干同種異體骨及同系骨骨誘導(dǎo)性及免疫原性的比較,探討復(fù)合環(huán)孢素A的同種異體骨在臨床上應(yīng)用的可能性。
　　 結(jié)論
　　 1、淋巴細(xì)胞二次刺激實(shí)驗(yàn)Alamarblue法和MTT法的選擇
　　 在本研究中檢測了不同濃度的BALB/C小鼠脾淋巴細(xì)胞在加入Alamarblue后不同時間所測得的吸光度值,并計(jì)算出相對應(yīng)的還原率。并對加入指示劑4h后Alamarblue的還原率及MTT的OD值進(jìn)行相關(guān)性分析。在

10、加入Alamarblue后,不同細(xì)胞濃度的還原率隨著作用時間的延長而增加,當(dāng)細(xì)胞濃度為2×105cell/ml,作用20h后還原率為78.3％,仍未達(dá)到100％。不同的細(xì)胞濃度在作用時間為0h(P>0.05)條件下不同細(xì)胞濃度與還原率之間的線性相關(guān)關(guān)系不明顯,2h(P<0.05)、4h(P<0.001)、6h(P<0.001.)、20h(P<0.001)條件下不同細(xì)胞濃度與還原率之間正性線性相關(guān)關(guān)系明顯。說明在細(xì)胞濃度在0.0625×1

11、05-2×105cell/ml時,加入Alamarblue后4、6、20h所得出的還原率均可間接反應(yīng)出細(xì)胞數(shù)量,從而在使用小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒試驗(yàn)中反映細(xì)胞存活的情況。如果進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)則推薦接種細(xì)胞密度為0.0625×105-0.5×105cell/ml,作用時間為4-6h。較高的細(xì)胞密度和較長的作用時間可能使所有檢測的樣本還原態(tài)的Alamarblue達(dá)到飽和狀態(tài)。如果進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),則可采用本研究的細(xì)胞接種濃度及培養(yǎng)時

12、間。
　　 Alamarblue法與MTT法的結(jié)果高度相關(guān)。在高濃度時Alamarblue法與MTT法組內(nèi)差異接近,均小于2％。低濃度時Alamarblue法與MTT法組內(nèi)差異接近,均小于2％。說明在高濃度、低濃度時Alamarblue法與傳統(tǒng)的MTT法相比穩(wěn)性及重復(fù)性并無明顯差異。
　　 2 復(fù)合環(huán)孢素A的同種異體骨與凍干同種異體骨及同系骨骨誘導(dǎo)性及免疫原性的比較
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,術(shù)后2w,三組間堿性磷酸酶

13、含量統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。環(huán)咆素組與同系組的堿性磷酸酶含量比凍干組高,環(huán)孢素組與同系組含量差異不明顯。組織學(xué)顯示三組植入骨粒周圍均沒有顯著的炎癥細(xì)胞浸潤。同系組植入骨粒骨小梁開始被吸收,條里變得模糊,凍干骨組植入骨粒骨小梁未被吸收,復(fù)合環(huán)孢素組植入骨粒的周圍骨小梁開始被吸收。術(shù)后4w,三組間堿性磷酸酶含量統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異,復(fù)合環(huán)孢素組與同系組含量差異不明顯。復(fù)合環(huán)孢素組與同系組的堿性磷酸酶含量比凍干組高。組織學(xué)表明同系組與復(fù)合環(huán)孢素組植

14、入骨粒已經(jīng)被吸收,可見大片新生的綠染的Ⅱ型膠原纖維,分布較均勻。凍干骨植入骨粒骨小梁大部分被吸收,新生膠原纖維較同系組及復(fù)合環(huán)孢素組少,主要以結(jié)締纖維組織為主。術(shù)后6w,三組間堿性磷酸酶含量統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。環(huán)孢素組與同系組的堿性磷酸酶含量比凍干組高,環(huán)孢素組與同系組含量差異不明顯。組織學(xué)6w時,三組植入骨粒周圍均沒有炎癥細(xì)胞浸潤。環(huán)孢素組及同系組開始出現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨,可見骨陷窩,及骨細(xì)胞。骨粒周圍開始出現(xiàn)紅染的膠原纖維,有層次感。凍干

15、骨骨可見植入骨粒內(nèi)出現(xiàn)新生的膠原纖維,排列雜亂。8w時三組間堿性磷酸酶含量統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。環(huán)孢素組與同系組的堿性磷酸酶含量比凍干組高,環(huán)孢素組與同系組含量差異不明顯。組織學(xué)8w時,同系組及復(fù)合環(huán)孢素組出現(xiàn)大片的紅染的成熟膠原纖維,呈現(xiàn)板層排列,部分樣本中間出現(xiàn)空腔,并含有髓腔內(nèi)容物.凍干骨組可見成熟膠原纖維與新生膠原纖維交錯分布,呈現(xiàn)紅綠相間染色。
　　 2w時各個組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)三組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著,4w三組間淋巴細(xì)