獼猴腸黏膜胃腸多肽與腸相關(guān)淋巴組織在發(fā)育中的演變.pdf

1、研究背景和目的：腸黏膜免疫是機體免疫系統(tǒng)的重要的組成部分，關(guān)于其生理或病理生理的知識在近10年增長極快，但研究的視角基本上集中在成年動物。生理條件下，發(fā)育過程中腸相關(guān)淋巴組織結(jié)構(gòu)和功能變化的規(guī)律尚未見系統(tǒng)研究。腸道因產(chǎn)生50余種胃腸多肽而被視為體內(nèi)最大的內(nèi)分泌器官，這些胃腸多肽的分子結(jié)構(gòu)、生理功能及在多種疾病發(fā)生中所起的作用一直受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，但很少有人關(guān)注它們在發(fā)育過程中的演變。生命科學(xué)的發(fā)展已經(jīng)揭示免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌這三個系統(tǒng)并不

2、是獨立運作，而是以“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”的形式，通過一些共同的介導(dǎo)物質(zhì)交換信息、相互作用。腸道正是這幾個系統(tǒng)相互應(yīng)答的重要場所。免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)在腸道發(fā)育過程中有無相互促進的可能?尚未見有研究回答這一問題。目前對腸黏膜免疫或神經(jīng)、內(nèi)分泌研究的大量資料主要來自嚙齒動物的研究。僅從嚙齒類動物的研究來推論人腸黏膜免疫的生理和病理生理過程，極易出現(xiàn)偏移和誤導(dǎo)。 從胚胎、幼年到成年，機體免疫器官的形態(tài)和功能都發(fā)生了巨大變化。但這

3、些變化規(guī)律是什么?不了解腸黏膜免疫的基本生理規(guī)律，就難以認(rèn)識其病理生理過程。為此，欲在探討發(fā)育過程中胃腸多肽的產(chǎn)量、分布、相應(yīng)受體的表達(dá)分布和結(jié)合能力等變化規(guī)律及不同發(fā)育階段獼猴腸黏膜免疫的發(fā)育生理的基礎(chǔ)上，了解胃腸多肽——腸黏膜免疫細(xì)胞微環(huán)境中的重要組成部分，在發(fā)育過程中是否影響腸黏膜免疫細(xì)胞的發(fā)育。這些知識的積累將有助于理解消化系統(tǒng)的發(fā)育、衰老、炎癥及腫瘤的發(fā)生。 方法：1.實驗所用獼猴來自成都野生動物世界。4只健康獼猴年齡

4、分別為胚胎6月、新生2天、新生45天及成年。進出成都野生動物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時所用獼猴均檢疫合格。 2.通過手術(shù)途徑獲得胚胎6月、新生2天、新生45天和成年獼猴的回腸、肝臟、門靜脈和外周血等標(biāo)本。 3.膠原酶消化法分離、不連續(xù)密度梯度離心純化小腸淋巴細(xì)胞。4.純化的小腸淋巴細(xì)胞在體外分別與SST、VIP孵育。 5.HE染色觀察腸相關(guān)淋巴組織的形態(tài)學(xué)變化；通過電鏡觀察淋巴細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 6.放射免疫分析法(

5、RIA)測定各標(biāo)本中的生長抑素(SST)和血管活性腸肽(VIP)含量。 7.免疫組化方法觀察SST、VIP、CD4+、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、黏附分子α4β7及MadCAM-1在腸、肝組織內(nèi)的分布。 8.流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞α4β7的表達(dá)情況 9.原位雜交檢測SST受體2型(SSTR2)和血管活性腸肽(VIPR1)的表達(dá)。 10.激光共聚焦顯微鏡觀察小腸及外周血淋巴細(xì)胞大小及骨架的影響。

6、 結(jié)果：1.在發(fā)育過程中，小腸內(nèi)SST、VIP含量逐漸增加，成年期時達(dá)最高水平，分別為120.1±35.3ng/mg蛋白和514.771±492.409ng/mg蛋白；較胚胎6月顯著增加，p＜0.01。 2.在發(fā)育的各階段，門靜脈SST、VIP水平始終高于外周血，p＜0.01。 3.胚胎和新生期小腸黏膜隱窩處可見少量SST陽性顆粒，至成年時黏膜隱窩處SST呈強陽性染色，胚胎期小腸粘膜上皮可見大量SSTR2表達(dá)，成年

7、時SSTR2表達(dá)下調(diào)，且主要定位于腺上皮隱窩處；胚胎及新生期肌層SST、SSTR2染色陰性，成年時可見小腸肌間神經(jīng)叢且SST、SSTR2陽性染色。 4.從胚胎到成年小腸上皮的VIPR-1的表達(dá)逐漸上調(diào)，在成年腸黏膜上皮內(nèi)VIPR-1分布較多。小腸肌層的VIP和VIPR-1主要見于成年期的環(huán)、縱行肌之間偏向環(huán)行肌側(cè)。 5.肝臟在發(fā)育過程中SST及SSTR2，VIP及VIPR1含量逐漸降低，胚胎6月，獼猴肝臟血管可見陽性VI

8、PR-1染色。出生以后至成年，肝臟血管VIPR-1染色逐漸轉(zhuǎn)陰。 6.胚胎和新生期，獼猴小腸不呈典型的PP形態(tài)；成年時，回腸末端小腸上皮下極易見到典型的PP，可見生發(fā)中心。 7.隨著不斷的發(fā)育，腸絨毛明顯增長、增多，呈分支狀，絨毛上皮中的黏液細(xì)胞也更密集，小腸腺發(fā)達(dá)。 8.在不同發(fā)育時期，獼猴小腸組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)無明顯差異。在不同發(fā)育時期，CD4+T細(xì)胞在上皮內(nèi)和固有層內(nèi)均有分布，但以上皮內(nèi)為多。在胚胎期

9、及新生2天，不成熟的PP呈CD4+陰性。但出生45天時，PP中有大量的CD4+T細(xì)胞，彌散分布于整個PP。進入成年，隨著生發(fā)中心的出現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞多集中于PP基底側(cè)的邊緣區(qū)。 9.胚胎和新生期小腸黏膜固有層和不成熟的PP均未見CD8+T細(xì)胞，但IEL呈CD8+弱陽性。在成年期有少量、散在的CD8+T細(xì)胞，分布于固有層及上皮間。 10.從胚胎到成年，NK細(xì)胞(CD57+)均主要位于固有層及黏膜下，上皮層及PP中未見有N

10、K細(xì)胞。 11.胚胎期和新生2天小腸黏膜淋巴組織未見有B細(xì)胞(CD20+)，隨著不斷的發(fā)育，B淋巴細(xì)胞增多，新生45天時，PP內(nèi)B細(xì)胞大量出現(xiàn)，呈均勻的CD20+。成年期B淋巴細(xì)胞則主要集中于PP腔側(cè)的邊緣區(qū)。 12.胚胎及新生2天，α4β7陽性染色見于IEL。新生45天時，IELα4β7陽性染色略減弱，LPLα4β7表達(dá)增加。進入成年，LPLα4β7表達(dá)強于IEL。固有層的α4β7染色主要沿上皮細(xì)胞基底部分布。

11、 13.從胚胎到成年，小腸絨毛上皮及固有層MadCAM-1染色均呈強陽性。固有層及上皮層的毛細(xì)血管呈MadCAM-1陽性染色。獼猴各發(fā)育階段小腸PP均未見α4β7陽性染色和MadCAM-1陽性染色。 14.SST(1×10-5mol/L)及VIP(1×10-6mol/L)作用于腸淋巴細(xì)胞后，與對照組比較，細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)線粒體明顯增多，膜系統(tǒng)出現(xiàn)，可見核糖體；但淋巴細(xì)胞上的α4β7的表達(dá)(SST=6.0％±0.82％，VIP

12、=8.0％±0.74％)與對照組(3.5％±0.46％)相比，無顯著差異，p＞0.05； 15.SST、VIP分別作用于小腸及外周血淋巴細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下測定其淋巴細(xì)胞面積、像素?zé)晒馕諒姸?，均較對照組顯著增加，p＜0.01。 結(jié)論：1.小腸分泌的SST及VIP進入門靜脈后，在進入肝臟前，大部分被很快降解，而并不像以前所認(rèn)為的是在肝臟被降解和代謝。 2.SST和SSTR2位于小腸絨毛的隱窩處；VIP陽性

13、神經(jīng)元主要位于小腸絨毛的隱窩部，而VIPR-1則散在分布于整個小腸絨毛。 3.由于SST免疫反應(yīng)陽性纖維沒有直接支配肌細(xì)胞，SSTR2仍分布于腸肌間神經(jīng)叢，因此SST抑制腸道運動的效應(yīng)可能是通過其它神經(jīng)纖維起作用。 4.從胚胎到成年，獼猴小腸壁內(nèi)的VIP最初來自黏膜下層的神經(jīng)，當(dāng)此處VIP神經(jīng)纖維由細(xì)增粗時，VIP神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)逐漸擴展至腸黏膜隱窩部及環(huán)、縱肌交界處。VIPR-1也主要分布于小腸環(huán)行肌。 5.獼猴胚

14、胎6月時，可見初級淋巴濾泡樣的集合淋巴結(jié)(Peyerpatch，PP)形成。隨著進食增加，新生45天時，初級淋巴濾泡樣的PP明顯增多，體積增大，但仍尚未發(fā)育為具有成熟的淋巴濾泡的PP。進入成年，回腸末端小腸上皮下極易見到具有生發(fā)中心的成熟淋巴濾泡樣的PP。α4β7和MadCAM-1并不是獼猴小腸PP形成和發(fā)育中的關(guān)鍵分子。提示獼猴PP發(fā)育與嚙齒類PP發(fā)育所涉及的趨化因素有很大差異。 6.胚胎期的不成熟PP、甚至整個小腸黏膜內(nèi)沒有

15、B細(xì)胞出現(xiàn)。成年獼猴小腸PP集中了大量B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞于一體，B細(xì)胞集中于PP腔側(cè)邊緣區(qū)，而CD4+T細(xì)胞則集中于PP的基底側(cè)。從作用場所的角度進一步支持了Th1、Th2與B細(xì)胞之間的生理上的相互影響的觀點。 7.從胚胎到成年，進入腸粘膜的淋巴細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上都沒有顯著差別。成年獼猴IEL均為T細(xì)胞，但CD4+T細(xì)胞多于CD8+T細(xì)胞；固有層內(nèi)未能觀察到B細(xì)胞的存在，而主要是CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞。這與來自嚙齒類的研究有