5-FU致小鼠腸黏膜損傷修復(fù)過(guò)程中腸上皮干細(xì)胞的作用機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)制備不同劑量5-FU致小鼠腸黏膜損傷模型，觀察小腸黏膜的組織學(xué)改變，檢測(cè)p糖蛋白1(p-glycoproteinl，p-g-p1)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen，PCNA)和腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)記物：musashi-1(msi-1)的表達(dá)變化，了解5-FU對(duì)小腸黏膜的損傷作用，探討腸黏膜損傷修復(fù)過(guò)程中腸上皮干細(xì)胞的作用機(jī)制。同時(shí)利用熒光染料Rhodamine123(Rho)對(duì)腸上皮

2、細(xì)胞進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其染色特征，觀察Rho染色陰性細(xì)胞比例在5-FU致腸黏膜損傷修復(fù)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，分離不同染色強(qiáng)度的細(xì)胞群，研究Rho染色陰性細(xì)胞是否具有腸上皮干細(xì)胞的特征，探討初步分離、純化腸上皮干細(xì)胞的方法。 方法：(1)小劑量5-FU致小鼠腸黏膜損傷模型：成年C57BL/6J小鼠50只，其中40只給予連續(xù)5天腹腔注射5-FU(30mg/kg.d)，另10只腹腔注射等量PBS作為空白對(duì)照。于5-FU注射結(jié)束后

3、1d、3d、5d和7d將小鼠剖殺取出中段小腸，光鏡下觀察腸黏膜病理改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Rho染色陰性細(xì)胞比例變化；RT-PCR檢測(cè)msi-1、p-g-p1mRNA表達(dá)情況；免疫組化分析msi-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及其百分比動(dòng)態(tài)變化。(2)大劑量5-FU致腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷模型：成年C57BL/6J小鼠40只，分為對(duì)照組(n=8，A組)和處理組(n=32)。A組給予腹腔注射PBS，處理組給予腹腔注射大劑量5-FU(150mg/kg.d×5d)，

4、分別于處理后1d(B組)、3d(C組)、5d(D組)剖殺瀕死小鼠取出小腸，常規(guī)HE染色，免疫組化檢測(cè)PCNA和腸上皮干細(xì)胞標(biāo)記物msi-1的表達(dá)；制備B組小鼠腸黏膜細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞檢測(cè)msi-1陽(yáng)性細(xì)胞比例。(3)利用Rho染色初步分離、純化腸上皮干細(xì)胞：利用Rho對(duì)小鼠腸上皮細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀分選Rho染色陰性和Rho染色強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞群；RT-PCR檢測(cè)Rho染色陰性和Rho強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞群細(xì)胞msi-1和p-g-p1mRNA的表達(dá)

5、；流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期和msi-1蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)小劑量5-FU作用后，光鏡下可見(jiàn)小鼠腸黏膜萎縮，間質(zhì)有少量中性細(xì)胞滲透；與對(duì)照組相比較，腸黏膜細(xì)胞中Rho陰性細(xì)胞比例顯著增高，以處理后1d最高，隨后逐漸下降(19.03±0.34；15.08±0.17；13.94±0.11；12.84±0.231vs.12.18±0.32，P<0.01)；msi-1mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，p-g-p1mRNA表達(dá)略有上升；msi-1

6、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量略有降低，但無(wú)顯著差異(5.70±0.83；5.73±0.87；5.80±0.85；5.97±0.92vs.6.17±0.87，P>0.05)，msi-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著增高(2.91±0.19；2.39±0.17；2.22±0.20；2.08±0.15vs.2.00±0.16，P<0.01)且與Rho陰性細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)(P<0.01，r=0.755)。(2)大劑量5-FU作用后，小鼠腸黏膜被嚴(yán)重破壞，黏膜萎縮，

7、絨毛、隱窩結(jié)構(gòu)消失；免疫組化結(jié)果顯示，在正常對(duì)照小腸組織中，msi-1主要表達(dá)在腸隱窩底部，潘氏細(xì)胞上面，大劑量5-FU作用后，與對(duì)照組比較，msi-1表達(dá)增加，msi-1陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增高(25.15±0.49；21.17±0.37；16.20±0.39vs.2.06±0.13，P<0.01)；PCNA在正常小腸組織中主要表達(dá)在腸隱窩中上部分，大劑量5-FU作用后，與對(duì)照組比較，PCNA的表達(dá)增加，PCNA指數(shù)顯著增高(26.90±

8、1.85；23.50±1.51；17.32±1.04vs.16.02±0.84，P<0.01)；流式檢測(cè)提示，根據(jù)細(xì)胞體積大小，B組小鼠腸黏膜細(xì)胞可分為兩群，其中前向角(FSC)數(shù)值較大即細(xì)胞體積較大的細(xì)胞群msi-1陽(yáng)性細(xì)胞比例較高，約為67.75％。(3)腸上皮細(xì)胞Rho染色特征：與造血干細(xì)胞染色特征類(lèi)似，腸上皮細(xì)胞Rho染色可明顯分為三個(gè)細(xì)胞群，分別是Rho染色陰性、Rho染色弱陽(yáng)性和Rho染色強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，分別約占總細(xì)胞的12.3

9、4％、45.26％和41.40％；成功分選出Rho染色陰性和Rho染色強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞群：前者msi-1和p-g-p1mRNA表達(dá)陽(yáng)性，后者p-g-p1mRNA少量表達(dá)；Rho染色陰性細(xì)胞大部分處于G0/G1期，約10.37％細(xì)胞msi-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性。 結(jié)論：Rho染色陰性細(xì)胞中含有豐富的腸上皮干細(xì)胞，利用腸上皮細(xì)胞的Rho染色特點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)腸上皮干細(xì)胞的初步分離、純化。Msi-1作為腸上皮干細(xì)胞的特異性的標(biāo)記物，可用來(lái)鑒定腸上皮干細(xì)胞