脂肪間質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合β磷本三鈣局部移植及系統(tǒng)應(yīng)用活性維生素D修復(fù)骨缺損的作用研究.pdf

1、研究背景:腫瘤、損傷及先天畸形導(dǎo)致的骨組織缺損一直是臨床醫(yī)生面臨的難題。多年來，學(xué)術(shù)界不斷探索針對骨組織缺損的修復(fù)方式，其中骨組織工程可謂是最有前景的治療手段之一。傳統(tǒng)的組織工程在修復(fù)骨缺損時，通常采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作為工程細(xì)胞與支架材料結(jié)合移植到骨缺損中。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在成骨分化、分泌骨基質(zhì)及誘導(dǎo)礦化方面的能力毋庸置疑，但是將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于臨床治療尚存在一些不利因素，例如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的儲量非常有限，提取過程復(fù)雜且創(chuàng)傷

2、大。因此，近年來，學(xué)者們開始嘗試探索其他來源的同樣具有多能分化潛質(zhì)的細(xì)胞來代替骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。這些細(xì)胞包括:脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、皮膚前體細(xì)胞、間皮細(xì)胞以及卵巢濾泡顆粒細(xì)胞等。他們具有干細(xì)胞性質(zhì)并可分化為三個胚層中任何一種細(xì)胞系。在這些細(xì)胞中，ADSC或許是最適合骨組織工程的細(xì)胞，因?yàn)樗隗w內(nèi)脂肪組織中存量相當(dāng)豐富，易于提取，收集過程創(chuàng)傷較小，且在體外生長迅速，對培養(yǎng)條件要求不高，經(jīng)過

3、簡單的成骨分化誘導(dǎo)就可以快速地表達(dá)成骨細(xì)胞特異性蛋白。ADSC程梭形，與支架材料親和性高，經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)后，可表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)特異性標(biāo)記物如:堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(ColⅠ)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)、及runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)等。除干細(xì)胞外，支架材料也是組織工程的重要組成要素，而骨組織工程應(yīng)用最廣泛的支架材料當(dāng)屬磷酸三鈣(TCP)。磷酸三鈣可分為兩個亞型即α-TCP和β-TCP。早期骨組織工程多選用α

4、-TCP作為支架材料，然而與α-TCP相比，近來備受關(guān)注的β-TCP具有更好的組織相容性，以及更接近于新骨形成速率的降解率，并且降解后無任何殘留。β-TCP與ADSC共培養(yǎng)時，ADSC可在24小時內(nèi)覆蓋β-TCP表面95％的面積。另外，β-TCP還具有一定的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的作用。組織工程最后一個重要構(gòu)成就是細(xì)胞因子，常用的細(xì)胞因子有骨形成蛋白2和7（BMP-2，BMP-7）等，BMP是一族生長因子家族，可調(diào)控骨及軟骨的形成，但BMP復(fù)

5、合支架材料價格相對昂貴，難以在臨床廣泛應(yīng)用。多年來，1，25(OH)2D3即維生素D體內(nèi)活性形式骨化三醇(calcitrol)及其類似物由于可以增加骨礦化密度(BMD)及相對低廉的價格，一直被用于治療骨質(zhì)疏松癥，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞均有維生素D受體(VDR)的表達(dá)。我們推測，calcitrol及其類似物可以直接作用于上述骨組織細(xì)胞，調(diào)節(jié)其功能活性。因此，我們希望通過將ADSC，β-TCP以及calcitrol或

6、其類似物結(jié)合起來，探索一種用于修復(fù)骨組織缺損的新型組織工程治療方案，并揭示其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)的目的在于通過一系列體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，來評價ADSC，β-TCP以及calcitrol結(jié)合修復(fù)骨缺損的效果，并深入探究活性維生素D及其類似物影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞功能活性的機(jī)制，最后，對比calcitrol及其類似物之一艾地骨化醇(eldecalcitol)在治療骨缺損效果上的差異，希望得到一種最佳的治療方案組合。
　　

7、實(shí)驗(yàn)方法:在第一階段研究中，我們提取大鼠皮下脂肪組織，分離獲得ADSC并于體外進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80％接觸后，將ADSC與預(yù)制備的β-TCP滅菌顆粒共同培養(yǎng)并將培養(yǎng)基更換為成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。共培養(yǎng)21天后，制備大鼠股骨缺損模型，并使用附有ADSC的β-TCP顆粒進(jìn)行修復(fù)。術(shù)后經(jīng)腹腔注射給予calcitrol（125ng/Kg，1次/2天），于治療第7天、14天及28天取股骨標(biāo)本，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，評價骨修復(fù)效果。在實(shí)驗(yàn)第二階段，

8、我們對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，并向培養(yǎng)基中分別加入calcitrol(10-8M)及eldecalcitol（10-8M），刺激7天及14天后提取總蛋白，通過westernblot檢測調(diào)控成骨細(xì)胞功能的Runx2，以及調(diào)控破骨細(xì)胞分化的核因子kB配體受體激活劑(RANKL)及骨保護(hù)素(OPG)等蛋白，以期揭示活性維生素D及其類似物調(diào)控骨形成及骨吸收的機(jī)制。在第三階段實(shí)驗(yàn)中，我們同樣制備大鼠股骨缺損模型，

9、在不進(jìn)行支架材料植入的情況下，經(jīng)口投給calcitrol（50ng/kg，1次/2天）及eldecalcitol（50ng/kg，1次/2天）治療，分別于28天及56天時，通過組織形態(tài)學(xué)手段，對比calcitrol及eldecalcitol在骨缺損修復(fù)中的效果。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:第一階段實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ADSC，β-TCP及calcitrol聯(lián)合用于骨缺損修復(fù)時，可以明顯增加新骨形成的量，同時，由于ADSC的存在，在新骨形成區(qū)域，檢測到高

10、水平表達(dá)的ALP和Runx2。Calcitrol在骨缺損修復(fù)早期，表現(xiàn)出對破骨細(xì)胞強(qiáng)烈的抑制作用，在減少破骨細(xì)胞數(shù)量的同時，也抑制了組織蛋白酶K(CK)的表達(dá)。第二階段實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在體外培養(yǎng)體系中加入calcitrol及eldecalcitol均可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞Runx2及OPG的表達(dá)，并抑制RANKL的表達(dá)。而calcitrol對MC3T3-E1的這種調(diào)控作用略強(qiáng)于eldecalcitol。第三階段實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在分別應(yīng)用calc

11、itrol（CAL組）和eldecalcitol（ELD組）治療骨缺損28天后，CAL組新骨形成量略高于ELD組，且兩實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對照組。治療56天后，CAL組和ELD組在新骨骨量上已沒有明顯差異，但ELD組新骨基質(zhì)中未礦化膠原面積略大于CAL組。CK染色顯示，28天時，calcitrol即表現(xiàn)出對CK陽性破骨細(xì)胞較強(qiáng)的抑制作用，而在ELD組，這種對破骨細(xì)胞的抑制作用在56天時才開始顯現(xiàn)。
　　結(jié)論:1.ADSC經(jīng)成骨分化誘導(dǎo)

12、，并以β-TCP為載體植入骨缺損后，可以大量表達(dá)ALP，并在缺損修復(fù)早期表達(dá)高水平的Runx2。2.活性維生素D體內(nèi)投給可明顯減少破骨細(xì)胞的數(shù)量，并且抑制CK的表達(dá)。3.Calcitrol及eldecalcitol可直接作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)Runx2及OPG的表達(dá)，促進(jìn)成骨，并可抑制成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，從而間接抑制破骨細(xì)胞分化。4.與eldecalcitol相比，calcitrol可以更快的促進(jìn)骨缺損區(qū)新骨的形成及礦化，且對破骨細(xì)胞