甘苦口服液大鼠體內的藥代動力學研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟遭受各種急慢性致病原侵襲，如:慢性乙型肝炎病毒，血吸蟲，酒精，藥物及代謝疾病等，引起肝臟損傷及炎癥反應時，機體進行代償性免疫修復而至肝內結締組織異常增生，肝內細胞外基質過度沉積的病理過程。輕者稱為肝纖維化，重者使肝小葉結構改建，假小葉及結節(jié)，成為肝硬化。肝炎患者如不及時治療，很有可能會發(fā)展成為肝硬化或肝癌。目前對于肝硬化及肝癌并無較好的治療方案，當病情發(fā)展至此，患者生存率極低。近年的基礎和臨床研究表明，如果能給予有效的病因

2、治療，或能直接抑制細胞外基質的合成和/或促進其降解，則已經(jīng)形成的肝纖維化甚至早期肝硬化也是可以逆轉的。因而，抗肝纖維也漸漸成為肝病治療中重要方案之一。
　　 目前，研究發(fā)現(xiàn)具有抗肝纖維化作用的藥物，如秋水仙堿，馬洛替酯，丹參，黃芪，苦參堿（Matrine，M），當歸，甘草等，有很多已經(jīng)應用于臨床，但其療效并不是很理想，為此，很多研究者都在試圖尋找理想的抗肝纖維化藥物。
　　 現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，M與甘草甜素(Glycyr

3、rhizin，GL)具有廣泛的藥理學作用:M具有抗感染，免疫調節(jié)，抗心律失常，降壓，抗腫瘤抗過敏，抗病毒和抗纖維化的作用，GL具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、護肝解毒、調節(jié)免疫功能等藥理作用。GL與M各自均有多種制劑在臨床中應用于肝纖維化、乙肝等的治療，如復方甘草酸苷片（美能），甘草酸二銨膠囊，甘草酸二銨注射液，復方甘草酸苷注射液，苦參堿注射液，鞣酸苦參堿片等。有較多文獻報道GL與M聯(lián)合治療慢性乙型肝炎效果良好，在降低肝纖維化指標上也有明顯優(yōu)

4、勢。如:索海芬[1]的臨床試驗表明:與單獨使用拉米夫定治療比較，苦參堿聯(lián)合甘草甜素治療在降低ALT、AST、HA、PCⅢ、Ⅳ-c以及TNF-α含量方面有優(yōu)勢，而且治療臨床總有效率高?？梢奙聯(lián)合GL有良好的抗肝纖維化的作用。
　　 本實驗室研制的甘苦口服液，主要成分即為GL與M。藥效學實驗表明，甘苦口服液對硫代乙酰胺誘導的大鼠肝纖維化治療作用優(yōu)于陽性對照復方甘草酸苷片（美能）;甘苦口服液較注射液而言，患者順應性大大提高，有利于慢性

5、乙肝患者的長期用藥。甘苦口服液應用于肝纖維化的治療，前景廣闊，值得進一步的研究與開發(fā)。
　　 文獻研究發(fā)現(xiàn)，M及GL單體的藥代動力學研究報道比較多，對于它們在大鼠體內的處置過程研究比較充分，但是并無二者合用的藥代動力學研究，因而，對于二者合用的非臨床前藥代動力學研究也顯得十分有必要。本文對甘苦口服液在大鼠體內的藥代動力學進行了初步的研究。
　　 本課題主要考察灌胃給予甘苦口服液后，GL及M在大鼠體內的藥代動力學特征，如吸

6、收、分布、排泄等。本課題的主要實驗有:1、測血漿中甘草次酸(glycyrrheticacid，GA)、M的RP-HPLC含量測定方法的建立;2、M在大鼠體內的藥代動力學初步研究;3、GL在大鼠體內的藥代動力學初步研究;4、GL與M之間在藥代動力學上的相互影響。
　　 1、血漿中GA、M的RP-HPLC含量測定方法的建立
　　 血漿中M含量測定采用的內標法，選用己酮可可堿作為內標。色譜條件為:流動相:乙腈∶0.1％H3PO

7、4水（三乙胺調PH至8）＝35∶65，流速:1mL·min-1，柱溫30℃，紫外檢測波長220nm。生物樣品預處理的方法為液液萃取法，生物樣品中的內源性雜質對于M的測定無干擾。經(jīng)方法學驗證，血漿中M在0.125-30mg·L-1濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，R2＝0.997，最低定量限為0.1mg·L-1，M的相對回收率為97.4％-104.1％，絕對回收率為60.6％-78％，日內、日間精密度分別為1.43％-1.66％、2.1

8、1％-2.77％，以上各項均達到方法學的要求。
　　 血漿中GA含量測定采用外標法，其色譜條件為:流動相:乙腈∶0.05％H3PO4水＝80∶20，流速:0.6mL·min-1，柱溫40℃，紫外檢測波長254nm，生物樣品預處理方法甲醇沉淀蛋白法，雖然樣品處理方法簡單，但是內源性雜質也并不影響GA的出峰。方法學驗證結果為:GA在0.005-10mg·L-1濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，R2＝0.999，最低定量限為0.00

9、5mg·L-1，GA的相對回收率為98.1％-103.1％，絕對回收率為65.6％-73％，日內、日間精密度分別為1.49％-1.62％、2.21％-2.89％，以上各項均符合方法學的要求。
　　 本文中建立的RP-HPLC方法簡便、準確、干擾少，靈敏度高，專屬性強，生物樣品預處理方法能夠很好的除去內源性雜質，適用于M和GL的體內藥代動力學的研究及其在體內的轉化過程和代謝途徑的研究。
　　 2、苦參堿在大鼠體內的藥代動力

10、學初步研究
　　 本文主要考察了大鼠灌胃給予不同劑量的甘苦口服液后的血藥濃度-時間曲線，組織分布和排泄。應用SPSS13.0對藥代動力學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，若方差齊，應用One-WayANOVA比較高、中、低劑量組間藥代動力學參數(shù)是否有統(tǒng)計學差異，若差異顯著，則應用Bonferroni法進行兩兩比較;方差不齊時，應用Welch法進行方差分析，若差異顯著，則應用DunnettT3法進行兩兩比較。
　　 血藥濃度-時間曲線實

11、驗:清潔級SD雄性大鼠15只，隨機分成3組，以口服液中主要成分苦參堿計，分別按140mg·kg-1，70mg·kg-1，35mg·kg-1灌胃給與甘苦口服液，于給藥后0.5，1,2，4，6，8，0，12，24h采血，應用HPLC檢測各大鼠不同時間點的血漿中苦參堿的濃度，得其血藥濃度-時間曲線，采用3P97藥代動力學軟件模擬房室模型并計算出藥代動力學參數(shù)。結果表明，大鼠灌胃給予不同劑量的甘苦口服液后，動力學過程均符合二室模型。苦參堿在體內

12、吸收迅速，Tmax為1.5h，高中低劑量組的AUC分別為98.60±8.66、37.24±6.21、17.73±3.35mg·L-1·h(p＜0.001)，Cmax分別為9.18±0.65、3.72±0.59、1.88±0.42mg·L-1(p＜0.001)，具有顯著性差異;AUC與Cmax呈劑量依賴型，隨給藥劑量的增加而增加。
　　 組織分布實驗:SD雄性大鼠20只，隨機分成4組，每組5只，灌胃給藥后分別于0.5，1,4，8h

13、取各組織，勻漿后應用HPLC檢測各組織中苦參堿含量，結果顯示:苦參堿能迅速分布于全身各組織，在心臟和肺分布較少，在肝臟、脾臟、腎臟分布較多，而肝脾腎出現(xiàn)最高濃度的時間不一樣，最高濃度出現(xiàn)在脾臟，8h時各組織中藥物濃度下降迅速，提示苦參堿在組織中蓄積并不明顯。
　　 排泄實驗:SD雄性大鼠5只，給藥后分時段收集尿液，并記錄尿量。HPLC檢測各大鼠不同時段尿液中M的濃度。結果顯示M在48h內排泄量占給藥量的27.143％，這也與文獻

14、報道中指出的M主要排泄方式為以原型從尿中排泄的結論相吻合。
　　 3、甘草甜素在大鼠體內的藥代動力學的初步研究
　　 本文主要考察了GL在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線與組織分布。應用SPSS13.0對藥代動力學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，若方差齊，應用One-WayANOVA比較高、中、低劑量組間藥代動力學參數(shù)是否有統(tǒng)計學差異，若差異顯著，則應用Bonferroni法進行兩兩比較;方差不齊時，應用Welch法進行方差分析，若差異

15、顯著，則應用DunnettT3法進行兩兩比較。
　　 血藥濃度-時間曲線實驗:清潔級SD雄性大鼠15只，隨機分成3組，以口服液中主要成分苦參堿計，分別按140mg·kg-1，70mg·kg-1，35mg·kg-1灌胃給與甘苦口服液，于給藥后1,2，4，6，8，12，24，36，48h采血，HPLC檢測各大鼠不同時間點的血漿中GA的濃度。結果顯示，GA在大鼠體內的藥動學過程屬于二室模型，動力學行為基本符合線性動力學過程。GA在大鼠

16、體內的吸收也呈劑量依賴型，高、中、低劑量組的AUC分別為40.24±7.02，21.95±2.60，11.768±2.183mg·L-1·h，(p＜0.01);Cmax分別為1.57±0.092，0.75±0.09，0.466±0.058μg·mL-1，(p＜0.01)，隨給藥劑量的增加而增加，但隨劑量的增加并未影響各組的分布容積，總清除率，和達峰時間。
　　 組織分布實驗:SD雄性大鼠20只，隨機分成4組，每組5只，灌胃給藥后

17、分別于1,4，8，12h取各組織，勻漿后應用HPLC檢測各組織GA含量，結果顯示:GA在心、脾、肺、腎中含量都較低，在肝臟中含量最高，而且明顯高于其他組織。肝臟中GA含量在1h較高，在4h時有所下降，隨后的8h，12h均增高，GA在大鼠肝臟有兩個峰濃度，這可能與GA在大鼠體內的吸收存在肝腸循環(huán)。
　　 4、苦參堿與甘草甜素在大鼠體內藥代動力學上的相互影響
　　 應用SPSS13.0對參數(shù)進行統(tǒng)計學分析:應用兩獨立樣本t檢

18、驗，檢驗中劑量組與M組之間的藥代動力學參數(shù)是否具有統(tǒng)計學差異。
　　 甘草甜素對苦參堿在大鼠體內藥代動力學的影響:SD雄性大鼠5只，灌胃給予70mg·kg-1純M（M組），于給藥后0.5，1,2，4，6，8，10，12，24h采血，HPLC檢測各時間點血漿中M含量，應用3P97軟件對血藥濃度進行擬合，得房室模型及藥代動力學參數(shù)，與給予甘苦口服液70mg·kg-1中劑量組比較，結果表明:GL對于M在大鼠體內的達峰時間及AUC無影響

19、，能夠降低M等濃度，增加了M的用藥安全性
　　 M對GL在大鼠體內的藥代動力學的影響:SD雄性大鼠5只，灌胃給予70mg·kg-1GL（GL組），于給藥后1,2，4，6，8，12，24，36，48h采血，HPLC檢測各時間點血漿中GA含量，應用3P97軟件對血藥濃度-時間對進行擬合，得房室模型及藥代動力學參數(shù)，與給予甘苦口服液70mg·kg-1中劑量組比較，結果表明:M減少了GA在大鼠體內的吸收，使GA在大鼠體內的Cmax降低，