知母皂苷B-Ⅱ在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、化合物知母皂苷B-II是從中藥材知母中提取的含有兩個(gè)糖鏈的水溶性甾體皂苷類化合物。前期藥理學(xué)研究表明此化合物具有顯著改善多種擬癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能的作用，在抗老年癡呆方面具有良好前景。為闡明知母皂苷B-II藥代動(dòng)力學(xué)特性，本研究考察了知母皂苷B-II在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為，其中包括不同大鼠品系的差異，飽食和禁食的差異等；觀察了知母皂苷B-II在大鼠體內(nèi)組織分布、代謝和排泄的情況，以求為進(jìn)一步臨床前和臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

2、　　 第一部分：大鼠血漿中知母皂苷B-II定量分析方法建立和確證
　　 根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和理化性質(zhì)，采用沉淀蛋白結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立了一種快速、專屬、靈敏和準(zhǔn)確的大鼠血漿中知母皂苷B-II的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法（HPLC-MS/MS）。經(jīng)過(guò)質(zhì)譜條件和液相條件優(yōu)化，最終確定了采用乙腈沉淀蛋白后，以重樓皂苷I為內(nèi)標(biāo)物﹙Internal Standard，IS﹚，色譜柱為GRACE公司Alltima HP C18柱（2.1×50 mm

3、，5μm）。分析流動(dòng)相為乙腈 ：1 mmol/L乙酸銨溶液（30 ：70，v ：v），流速0.2 ml/min，柱溫 ：室溫。檢測(cè)方式為負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），采用氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI)方式電離。方法學(xué)驗(yàn)證參考FDA關(guān)于分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和SFDA對(duì)用于藥代動(dòng)力學(xué)研究方法學(xué)的要求，考察了精密度和準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、稀釋線性和穩(wěn)定性(4°C進(jìn)樣盤(pán)中12 h的穩(wěn)定性、反復(fù)凍融和長(zhǎng)期穩(wěn)定性)等參數(shù)。結(jié)果表明：知母皂苷B-I

4、I在大鼠血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為5-2000 ng/mL，最低定量下限(LLOQ)為5ng/mL。質(zhì)控樣品的高、中、低三種濃度日內(nèi)和日間精密度均<10.3％，準(zhǔn)確度為-3.7％-7.5％。知母皂苷B-II在大鼠血漿中不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，乙腈沉淀蛋白方法的知母皂苷B-II提取回收率高、中、低濃度分別為91％，112％，107％。方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果表明采用此方法測(cè)定的藥物濃度準(zhǔn)確、可靠，其測(cè)定誤差滿足藥代動(dòng)力學(xué)研究方法學(xué)的要求限度。

5、>　　 第二部分：SD大鼠單次ig 不同劑量知母皂苷B-II后藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)
　　 研究了單次灌胃給予不同劑量（20，40，80 mg/kg）知母皂苷B-II后血漿中藥物濃度-時(shí)間變化。結(jié)果表明知母皂苷B-II在大鼠體內(nèi)的血藥濃度個(gè)體差異大，個(gè)體達(dá)峰時(shí)間（Tmax）及峰濃度（Cmax）變異很大，提示藥物的吸收很不規(guī)則。各組內(nèi)多數(shù)大鼠血藥濃度于給藥后5～30 min達(dá)峰，提示知母皂苷B-II灌胃后迅速吸收，胃及消化道上段可能是其

6、有效吸收部位。各劑量組AUC(0-t)比值（1：1.4：2.6）與劑量之比（1:2:4）不呈線性。隨劑量增高，藥時(shí)曲線雙峰現(xiàn)象呈明顯趨勢(shì)，導(dǎo)致雙峰現(xiàn)象的原因可能為腸肝循環(huán)和/或胃腸消化道的不均一吸收。SD大鼠iv 20 mg/kg 知母皂苷B-II后，血藥濃度于給藥后的第一個(gè)觀測(cè)點(diǎn)5min達(dá)峰，峰濃度為185833.3 ng/mL，隨后血藥濃度隨時(shí)間顯著下降，給藥1.5h后絕大多數(shù)血藥濃度已降至峰濃度的1/100或以下，以20 mg·k

7、g-1 iv給藥組的歸一化AUC(0-t)為分母，大鼠80 mg/kg ig給藥組的絕對(duì)生物利用度僅為0.11±0.09％。
　　 第三部分：Wistar大鼠單次ig 不同劑量知母皂苷B-II后藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)
　　 由于知母皂苷B-II在SD 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為表現(xiàn)個(gè)體差異大，因此選擇另一品系嚙齒類動(dòng)物Wistar大鼠研究知母皂苷B-II在其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明知母皂苷B-II在Wistar大鼠和SD大鼠體內(nèi)

8、藥代動(dòng)力學(xué)行為相似，均表現(xiàn)為個(gè)體差異大，吸收不規(guī)則，生物利用度低的特點(diǎn)。
　　 第四部分：比較SD大鼠在飽食和禁食兩種狀態(tài)下藥代動(dòng)力學(xué)行為差異
　　 由于在禁食條件下，知母皂苷B-II在大鼠體內(nèi)口服表現(xiàn)吸收不規(guī)則、個(gè)體差異大，生物利用度低等特點(diǎn)，同時(shí)大量藥理研究表明食物對(duì)藥物的吸收產(chǎn)生促進(jìn)、抑制甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。為評(píng)價(jià)食物對(duì)知母皂苷B-II PK的影響，本部分探討了禁食和飽食狀態(tài)下知母皂苷B-II在SD大鼠體內(nèi)的藥

9、動(dòng)學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明大鼠在飽食和禁食兩種狀態(tài)下均觀察到雙峰現(xiàn)象，與禁食口服給藥后的藥時(shí)曲線相似。飽食組第一吸收峰顯著高于空腹組，且由于食物的存在使吸收更加不規(guī)則。相同劑量相同給藥途徑下，大鼠的飽食組和空腹組AUC(0-t)分別為221.05±157.75和201.81±178.70 ng·h/mL，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)意義差別，但均值上飽食組較禁食組增加約10％，結(jié)果表明食糜的存在使知母皂苷B-II的吸收增加，但也會(huì)使藥物吸收更加不規(guī)律。
　

10、　 第五部分：研究了SD大鼠灌胃給予知母皂苷B-II后組織分布，膽汁和糞尿排泄
　　 大鼠灌胃給予40mg/kg知母皂苷B-II后，選擇給藥后30 min，2 hr和8 hr (涵蓋吸收相、分布相和消除相) 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死大鼠，取大腦、小腦和腦干、心、肝、脾、肺、腎、胃、胃內(nèi)容、十二指腸及其腸內(nèi)容、直腸腸內(nèi)糞、腦、骨骼肌、脂肪、生殖腺和體液等19種組織或器官，測(cè)定知母皂苷B-II在這些組織或器官的濃度。排泄研究觀察了大鼠給

11、予80 mg/kg知母皂苷B-II后至96 h的糞尿排泄情況及給藥后至24 h的膽汁排泄情況。結(jié)果表明：灌胃40 mg/kg知母皂苷B-II水溶液后，其在組織中的暴露水平由低到高依次為：小腦、腎、腦干、大腦、脾、肺、心臟、生殖腺、肌肉、肝、血漿、脂肪、腸內(nèi)糞、腸內(nèi)容、尿、小腸、胃和胃內(nèi)容，提示化合物知母皂苷B-II主要分布在消化道（如：胃、腸和消化道內(nèi)容物）。藥物在大腦、小腦和腦干中也有少量分布，且沒(méi)有時(shí)相變化。在大多數(shù)組織中，知母皂苷

12、B-II濃度在0.5h達(dá)到高峰，提示藥物在組織中有很快的分布速度。灌胃80 mg/kg知母皂苷B-II水溶液后，24小時(shí)內(nèi)藥物經(jīng)膽汁排泄累積率是2.54±1.59％，96小時(shí)內(nèi)在糞和尿中知母皂苷B-II累積排泄率是0.0188±0.0090％，96小時(shí)內(nèi)在尿和糞累積排泄率分別是0.0144±0.0082％，其中糞只在6-12 h檢測(cè)到微量原形物，在24 h后基本檢測(cè)不到原形。結(jié)合分布實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)知母皂苷B-II物主要以代謝物形式排泄