生長抑素對獼猴腸缺血再灌注后腸道菌群的影響的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的 多器官功能障礙(multiorgan dysfunction syndrome，MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴重的并發(fā)癥，在MODS的病理生理的研究中，腸源學說和炎癥反應失衡學說是目前得到廣泛認可的MODS的主要發(fā)病機制。腸缺血再灌注損傷后，腸道細菌及毒素移位是腸源學說的主要機制。以往的研究多關注腸粘膜損傷及細菌移位的后果，但對于腸道菌群的變化以及細菌移位究竟發(fā)生于何處卻未涉及，而作為細菌移位的前提，研究腸道菌群的

2、變化情況及其原因，對于預防細菌移位及制定正確的臨床監(jiān)護措施意義重大。由于尚無有效的治療手段，MODS死亡率極高，至今仍是醫(yī)學面臨的重大難題。生長抑素(somatostatin，SST)是由神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道產(chǎn)生的一種廣泛分布于體內的胃腸多肽，具有多種生理功能。已有研究報道SST抑制IIR時的氧化應激，改善了MODS的組織學改變。但SST改善獼猴MODS所涉及的機制是否與小腸細菌量及菌群變化有關，尚未見報道。 本研究旨在了解腸缺血

3、再灌注后獼猴腸道菌群的變化及其對機體的影響，并從胃酸變化和腸道動力變化的角度探討腸道菌群變化的原因；明確胃腸多肽與腸道細菌之間有無直接的相互作用；探討生長抑素干預對腸缺血再灌注后腸道菌群的影響，以期闡明生長抑素是否可通過改善腸道菌群紊亂而影響腸缺血再灌注損傷對機體的影響。 方法 1．實驗動物：全部實驗所用健康成年獼猴來自成都野生動物世界，雌雄不限，體重4～6Kg。獼猴進出成都野生動物世界獼猴喂養(yǎng)區(qū)時均檢疫合格。

4、2．實驗分組：15只健康成年獼猴隨機分為對照組、腸缺血再灌注組和生長抑素干預治療組。腸缺血再灌注組動物行腸系膜上動脈夾閉—松夾閉術；生長抑素干預組在夾閉腸系膜上動脈前，靜脈滴注生長抑素5μg／kg／h。 3．各組動物實驗結束后，觀察組織器官大體改變，獲取胃液、門靜脈血、外周血及回腸、結腸組織。 4．HE染色法觀察回腸及結腸組織形態(tài)學變化。 5．用精密pH試紙測定胃液的pH值。 6．小腸及結腸灌洗液、粘膜組

5、織分別進行需氧和厭氧細菌培養(yǎng)及菌落計數(shù)分析小腸及結腸腔菌群及膜菌群。 7．采門靜脈血行血培養(yǎng)觀察有無菌血癥。 8．采用鱟試驗法測定門靜脈血中內毒素水平。 9．放射免疫測定法(RIA)檢測回腸全層組織勻漿、粘膜勻漿以及門靜脈和外周血中生長抑素(SST)、血管活性腸肽(VIP)及P物質(SP)含量。 10．免疫組化方法觀察SST、VIP、SP、Toll樣受體2及Toll樣受體4在小腸組織內的分布。 1

6、1．獲得純培養(yǎng)的獼猴大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌分別與SST、VIP、SP在體外共同培養(yǎng)，觀察細菌與胃腸多肽之間的相互作用。 結果 1．正常獼猴小腸無菌率達40％，而腸缺血再灌注后所有動物小腸細菌培養(yǎng)均為陽性，P<0.05。 2．獼猴IIR后，小腸及大腸腔內細菌較正常分別增加約2×10<'6>倍和1×10<'2>倍，P<0.01。均以大腸桿菌等需氧菌為優(yōu)勢菌群。 3．獼猴IIR后回腸粘膜中Toll樣受體2及

7、Toll樣受體4表達明顯增強，以上皮細胞膜上的表達更為明顯。 4．獼猴IIR后，回腸粘膜出血壞死損傷明顯，結腸病變輕微。 5．對照組獼猴均無菌血癥，IIR組大腸桿菌菌血癥達100％，P<0.01。 6．IIR后，小腸明顯充血擴張，胃內pH值由2.8±0.84增至7.2±0.84，P<0.01。 7．免疫組化結果表明胃腸多肽(SST、VIP、SP)很少在粘膜下層表達，全腸壁組織中的胃腸多肽主要存在于肌層及粘

8、膜層。 8．全回腸組織中胃腸多肽(SST、VIP、SP)明顯增加，P<0.01；而粘膜中SST及VIP的濃度卻減少，P<0.01。 9．胃腸多肽與腸道細菌共同培養(yǎng)后，胃腸多肽的含量及細菌數(shù)量均無明顯變化。 10．以5μg／kg／h的劑量靜脈輸入SST后，外周血及門靜脈血中SST水平分別為29.3±5.97pg／ml和9.1±0.71pg/ml，較IIR(3.67±0.41pg/ml和4.49±0.33pg/ml)

9、時明顯升高，P<0.01。 11．SST干預后，小腸充血擴張明顯改善；小腸粘膜內SST恢復；小腸絨毛形態(tài)及粘液層完整，無粘膜下出血及片狀粘膜糜爛。 12．SST干預后小腸腔菌群和膜菌群中需氧菌總數(shù)較ⅡR時明顯下降，分別減少約10<'3>(p<0.01)和10<'2>倍(p<0.05)，其中均以大腸桿菌減少為主，厭氧菌/需氧菌比值均較ⅡR組顯著上升，基本達到正常水平，大腸桿菌厚L酸桿菌的比值也降至正常。 13．SS

10、T干預后，門靜脈血中的LPS水平(0.59±0.13EU/ml)較ⅡR組(1.48±0.32EU/ml)顯著下降，p<0.01；與正常組(0.33±0.03EU/ml)相比無差異，p>0.05。 14．SST干預后，胃內未見膽汁反流，其pH值為5.4±0.55，與ⅡR(7.2±0.84)相比，顯著下降，p<0.05；但仍高于正常對照組2.8±0.84，p<0.05。 15．ⅡR時，與正常對照相比，回腸肌層中SST增加了1

11、31[％]，VIP增加了257.3[％]，p<0.01；SST干預后，回腸肌層SST和VIP較ⅡR分別減少了220[％]和249.2[％]，二者均已與正常時無明顯差別，P>0.05。 結論 1．盡管獼猴的食物衛(wèi)生狀況遠不如人類，但正常獼猴小腸菌群與人類相似，提示獼猴決定小腸菌群的上消化道綜合殺菌機制可能較人類更為強大。 2．ⅡR后結腸細菌總量及大腸桿菌等需氧菌數(shù)量雖然也明顯增加，厭氧菌對結腸粘膜的保護功能可能有所

12、削弱，但獼猴結腸粘膜損傷并不明顯，也未出現(xiàn)腹瀉，表明ⅡR后大量繁殖的大腸桿菌的致病靶組織并不在結腸粘膜。 3．大腸桿菌通過回腸TLR4介導，導致小腸粘膜屏障的嚴重急性損傷，成為細菌移位的門戶。 4．ⅡR后，胃內酸度降低，胃酸的殺菌功能喪失，是小腸細菌過度生長的重要原因之一。 5．小腸動力低下是ⅡR時，腸道菌群紊亂的重要啟動因素；而菌群紊亂又加劇了小腸麻痹，二者形成惡性循環(huán)。 6．大腸桿菌、腸球菌及乳酸桿菌

13、并不能裂解胃腸多肽，而且胃腸多肽在體外與各種細菌共同孵育后也并未表現(xiàn)出對細菌生長的促進或抑制作用。 7．獼猴ⅡR后，小腸細菌過度生長既可能由小腸動力降低直接導致，也可能是小腸動力降低-膽汁反流-胃內pH值升高-上消化道殺菌屏障破壞等系列事件的后果。小腸肌間神經(jīng)叢中的SST及VIP增加可能是此刻小腸動力降低的啟動因素。 8．ⅡR后，循環(huán)中生長抑素水平顯著下降，靜脈滴注生長抑素5μg/kg/h即可有效恢復循環(huán)中生長抑素濃度。