一種重組抗EGFR單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、EGFR（Epithelial growth factor receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體）是由原癌基因C-erbB-1(HER-1)編碼的分子量為170 KDa（Kilodalton，千道爾頓）的跨膜糖蛋白。EGFR本身具有酪氨酸激酶的活性，一旦與EGF（Epithelial growth factor，表皮生長(zhǎng)因子）或者其它相關(guān)配體結(jié)合即可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激有關(guān)基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，因此EGFR在細(xì)胞生理過(guò)

2、程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。人們?cè)谠S多上皮惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有EGFR的異常高表達(dá)，證實(shí)EGFR與癌細(xì)胞的快速增殖、新生血管的形成、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，以及細(xì)胞凋亡的抑制等等有關(guān)，因此提示EGFR有可能成為治療腫瘤疾病的潛在靶點(diǎn)?？笶GFR單克隆抗體是能夠與EFGR特異性結(jié)合，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制EFGR與其配體結(jié)合，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖信號(hào)傳導(dǎo)的靶向性抗體。目前最早上市的抗EGFR單克隆抗體是2004年被美國(guó)FDA(the Food andDrug

3、 Administration)批準(zhǔn)的西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux(@))，是一種重組的抗EGFR人鼠嵌合單克隆抗體，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌。該產(chǎn)品已于2009年獲批進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)銷售，中文商品名:愛(ài)必妥。Erbitux的生產(chǎn)制備使用了SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
　　上?？贵w藥物國(guó)家工程研究中心利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種重組抗EGFR人鼠嵌合單克隆抗體(Recombinant Chimeric Anti-E

4、GFR Monoclonal Antibody，以下簡(jiǎn)稱Anti-EGFR)。該抗體是原研藥Erbitux的生物類似藥(Follow-On Biologics，F(xiàn)OB)，所不同的是該抗體的生產(chǎn)制備采用了CHO（Chinese Hamster Ovary Cell，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)并使用了自有的抗體生產(chǎn)工藝技術(shù)。單克隆抗體(MonoclonalAntibody，mAb)是一類大分子糖蛋白，有研究表明，細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)

5、程以及細(xì)胞培養(yǎng)條件會(huì)影響蛋白質(zhì)的糖基化修飾，而蛋白質(zhì)糖基化又與某些蛋白質(zhì)功能相關(guān)，因此，為了了解和比較兩種不同細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所生產(chǎn)的重組抗EGFR單克隆抗體在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能方面存在哪些異同，以及受試藥Anti-EGFR是否可以成為抗腫瘤治療藥物的候選藥，本研究將以原研藥Erbitux作為參考對(duì)照，針對(duì)受試藥Anti-EGFR的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析和確證，并對(duì)其體內(nèi)外抗腫瘤功能進(jìn)行了研究和評(píng)價(jià)。
　　在抗體結(jié)構(gòu)表征分

6、析中，本研究分別從一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)上對(duì)受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux的異同進(jìn)行了全面和深入研究。首先，應(yīng)用LC-ESI-Q-TOF技術(shù)，從質(zhì)譜分子量、質(zhì)量肽圖、糖基化修飾逐步解析受試藥Anti-EGFR的一級(jí)結(jié)構(gòu)信息，并對(duì)差異進(jìn)行重點(diǎn)解剖。我們研究發(fā)現(xiàn)，受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux具有相同的氨基酸序列，但在糖基化上存在重大差異:原研藥Erbitux唾液酸化以NGNA型為主，含有較多galac

7、tose-a-1，3-galactose結(jié)構(gòu)寡糖修飾，高甘露糖水平是受試藥Anti-EGFR的6倍，存在較大的免疫原性風(fēng)險(xiǎn);受試藥Anti-EGFR唾液酸化以NANA型為主，基本不含α1-3型半乳糖;由于我們采用了與人細(xì)胞更接近的CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)從而規(guī)避或大大降低了原研藥Erbitux潛在的免疫原性高風(fēng)險(xiǎn)。其次，本研究還分析確證了兩種抗體的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)情況:受試藥Anti-EGFR與原研藥Erbitux的熱熔變化趨勢(shì)基本一致（Tm值

8、基本一致），表明其折疊和穩(wěn)定性基本一致;通過(guò)CD遠(yuǎn)紫外區(qū)和近紫外區(qū)掃描分析，顯示兩種單抗二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的高度類似性;而且通過(guò)分子內(nèi)部熒光分析，兩種抗體的芳香族氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)構(gòu)象基本一致，蛋白質(zhì)整體空間構(gòu)象沒(méi)有發(fā)生變化。
　　兩種抗體的體外藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，受試藥Anti-EGFR在抗原結(jié)合能力、細(xì)胞增殖抑制能力以及ADCC作用方面與原研藥Erbitux類似;受試藥Anti-EGFR抗體能夠顯著抑制EGFR及其下游信號(hào)通

9、路的磷酸化，并且對(duì)人表皮細(xì)胞癌A431(EGFR高表達(dá)的人腫瘤細(xì)胞株)具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。
　　兩種抗體的體內(nèi)藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，受試藥Anti-EGFR對(duì)人表皮細(xì)胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用非常顯著，并且對(duì)受試藥Anti-EGFR處理后的腫瘤組織進(jìn)行免疫組化的分析，進(jìn)一步確證受試藥Anti-EGFR通過(guò)抑制腫瘤組織中EGFR磷酸化，抑制EGFR所參與調(diào)控的與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制腫瘤

10、細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　本研究結(jié)果證實(shí)，受試藥Anti-EGFR設(shè)計(jì)與原研藥Erbitux相同的氨基酸序列和不同的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，達(dá)到大大降低引起免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的NGNA、galactose-a-1，3-galactose結(jié)構(gòu)、高甘露糖糖基化含量的設(shè)計(jì)目的，同時(shí)保證在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)方面高度類似，蛋白質(zhì)整體空間構(gòu)象沒(méi)有發(fā)生改變，確保所期望的功能和藥效，并且在隨后的體內(nèi)外藥學(xué)研究中證實(shí)，受試藥Anti-EGFR對(duì)