UGT1A3和UGT1A9的異源表達(dá)與黃酮類代謝及UGT1A3基因多態(tài)性研究.pdf

1、對(duì)有機(jī)生物而言，絕大多數(shù)藥物屬于生物異源物質(zhì)，一旦藥物進(jìn)入機(jī)體，就要被機(jī)體代謝。葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是其中一種普遍的II相代謝反應(yīng)，在此反應(yīng)中藥物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)的催化下，與內(nèi)源性的葡萄糖醛 到目前為止，很多人類UGTs蛋白都已在體外獲得了異源表達(dá)，其它種屬UGTs的體外表達(dá)也時(shí)有報(bào)道。但國內(nèi)在此方面豹研究起步較晚。在本文中，我們嘗試中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)和Bac-to-Bacr桿狀病毒感染的昆蟲表

2、達(dá)系統(tǒng)，獲得了活性重組UGT1A3和UGT1A9蛋白，并以此比為模型，對(duì)重要的tJGrs O-葡萄糖醛酸結(jié)合底物-黃酮類-展開了一系列代謝研究。 一.采用CHL系統(tǒng)和Bac-to-BacR系統(tǒng)表達(dá)活性人UGT1A3及UGT1A9uGTs超基因家族，根據(jù)氨基酸序列的同源性，可分為4個(gè)亞族：UGTl，UGT2，UGTl3和UGT8。在這些同工酶中，UGT1和UGT2亞族，尤其是前者，與外源物代謝的關(guān)系最為緊密。人類UGT1A基因位于

3、染色體2q37處，至少由13種不同的第一外顯子和4個(gè)共同的外顯予2．5組成。本文的研究模型UG"nA3和UGT1A9分別是UGT1A亞族中的第三號(hào)和第九號(hào)活性蛋白。我們先后嘗試了CHL，和Bac-to-Bacr表達(dá)系統(tǒng)，以獲得滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的活性UGT1A3和UGT1A9蛋白。 1．活性UGT1A3在CHL細(xì)胞中的異源表達(dá)本實(shí)驗(yàn)以病人病灶組織旁的正常肝或胃組織的總RNA為模版，使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)獲得U

4、GT1A3*2a基因。該基因與野生型UGT1A3*1基因相比具有3個(gè)單核苷酸突變，分別為(T31C，w11R;G81A,E27E和T140C。V47A)。這其中2個(gè)是有義突變(T31C，w11R和T140C,V47A)，1個(gè)是靜默突變(G81A. E27E)。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，UGTlA3*2a被亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，通過改良的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入CHL中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。由于pcDNA3.1(+)載體帶有G418抗

5、性基因，我們采用400μg/ml的G418進(jìn)行篩選，直至未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞完全死亡。篩選過后，我們以有限稀釋法獲得有抗性的單克隆，并用RT-PCR的方法確證了人UGT1A3*2a基因在單克隆中的表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞超聲破碎，包含有重組蛋白的細(xì)胞破碎液被用于進(jìn)一步的孵育實(shí)驗(yàn)以測(cè)定重組酶的活性。 以槲皮素為底物，在含有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)的葡萄糖醛酸體外孵育系統(tǒng)中，重組UGT1A3.2酶代謝槲皮素產(chǎn)生1個(gè)槲皮素葡萄糖醛酸苷。該

6、代謝物在孵育液的HPLC分析中被檢測(cè)到，其二極管陣列光譜(DAD)與底物槲皮素十分相似，且經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶水解后消失，表明重組人UGT1A3*2a在CHL表達(dá)系統(tǒng)中獲得了異源活性表達(dá)。 2．活性u(píng)GT1A3和UGT1A9在Bac-to-Bacr表達(dá)系統(tǒng)中的異源表達(dá)本實(shí)驗(yàn)以Bac-to-Bacr桿狀病毒感染的Sf9昆蟲表達(dá)系統(tǒng)來獲得大量高活性的UGT1A3和UGT1A9重組蛋白。實(shí)驗(yàn)首先以。pcDNA3.1(+)-UGTlA3*

7、2a為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和定點(diǎn)突變獲得需要的UGT1A3*1野生型序列，并通過引物設(shè)計(jì)插入了6個(gè)組氨酸的His-tag序列，將該基因序列連入pFastBacTM1載體中。同時(shí)以pcDNA3.1(+)-UGT1A9質(zhì)粒為模板，運(yùn)用PCR在基因的兩側(cè)加入AflⅡ和XhoI的酶切位點(diǎn)，連入pFastBaeTMl載體，構(gòu)建了pFastBacTM1-UGT1A9重組質(zhì)粒。重組pFastBacTM1-UGTIA9, pFastBacTM1-UGT

8、1A3質(zhì)粒在MAX EfficiencyDHlOBacTm competent Escherichia coli中發(fā)生轉(zhuǎn)座，以。PCR鑒定轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的重組粘粒。將重組粘粒與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒，感染Sf9細(xì)胞，72h后收集蛋白，采用RT-PCR和Westernblot進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定。為了檢測(cè)表達(dá)蛋白的體外活性，我們以槲皮素為底物，對(duì)UGT1A3/UGT1A9重組酶進(jìn)行了酶活性初試。在含有UDPGA的葡萄糖醛

9、酸體外孵育系統(tǒng)中，重組UGT1A3酶和UGT1A9酶均代謝槲皮素產(chǎn)生4個(gè)槲皮素葡萄糖醛酸苷，這與人肝微粒體孵育結(jié)果相同。在Sf9細(xì)胞中獲得的重組蛋白在前100 min的孵育中呈現(xiàn)良好穩(wěn)定的活性，其活性明顯高于用v79，CHL細(xì)胞系獲得的人UGT1A9和UGT1A3.2重組蛋白，且滿足本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件的靈敏度要求，該方法產(chǎn)生的代謝酶可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的定量研究。 二．UGT1A3和UGT1A9對(duì)槲皮素的區(qū)域選擇性研究槲皮素，這一廣泛分

10、布的飲食類黃酮，在體內(nèi)幾乎只能檢測(cè)到其代謝物，故其行使藥理活性，至少部分通過代謝物進(jìn)行。葡萄糖醛酸結(jié)合是槲皮素吸收后的主要結(jié)合途徑，不同的槲皮素葡萄糖醛酸苷具有顯著不同的藥理活性。因此，UGT酶對(duì)槲皮素各個(gè)羥基的區(qū)域選擇性可能決定了該酶對(duì)槲皮素藥理活性的貢獻(xiàn)。 在本實(shí)驗(yàn)中，從Bac-to-Bacr表達(dá)系統(tǒng)中獲得的UGT13A3和UGT1A9被用于催化槲皮素的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，它們對(duì)于槲皮素各羥基的區(qū)域選擇性通過各個(gè)羥基的動(dòng)力學(xué)

11、參數(shù)計(jì)算定量評(píng)估。Lc一．MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩個(gè)酶都催化槲皮素生成4個(gè)槲皮素單葡萄糖醛酸苷。經(jīng)HPLC分離后，我們收集了每個(gè)單葡萄糖醛酸苷，并利用黃酮的uV光譜確定了每個(gè)苷的結(jié)構(gòu)，它們分別是槲皮素7-，3-，4-和3-葡萄糖醛酸苷。每個(gè)單葡萄糖醛酸苷的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)被確定，并用于定量分析UGTA13和UGT1A9對(duì)槲皮素的區(qū)域選擇性。UGT1A3最偏好生成3-葡萄糖醛酸苷，然后是3-，4r-和7-葡萄糖醛酸苷?？紤]到槲皮素-3’-葡萄糖醛

12、酸苷的低抗氧生理活性以及UGT1A3本身較弱的槲皮素總催化活性，表明UGT1A3在槲皮素的藥理活性中只扮演一個(gè)有限的角色。而對(duì)UGT1A9來說，催化效率的順序是3->7->3->4’-葡萄糖醛酸苷，槲皮素-7-葡萄糖醛酸苷的高抗氧活性和以及UGT1A9較強(qiáng)的槲皮素總催化活性，表明UGT1A9對(duì)于槲皮素的生理活性十分重要。 三．UGT1A3和UGT1A9對(duì)黃酮類的代謝研究黃酮是最常見和廣泛分布的一類多酚化合物，黃酮的很多健康有益特

13、性已經(jīng)通過體外實(shí)驗(yàn)被報(bào)道。如果不了解黃酮的體內(nèi)生物利用度、與胃腸道的相互作用、結(jié)合、代謝等情況，就無法由體外實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)其體內(nèi)的抗氧化活性。 葡萄糖醛酸結(jié)合是黃酮吸收后三條主要的結(jié)合途徑之一。本文中，重組UGT1A3和UGT1A9被用于19個(gè)黃酮底物的結(jié)合研究，其中的11個(gè)化合物能夠被UGT1A3或者UGT1A9代謝。異鼠李素，桑色素，水飛薊，山萘酚，黃豆苷元，槲皮素-3’，4’-OCHO-，槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷是本文首次報(bào)道的

14、UGT1A3底物.-而菜素，桑色素，黃豆苷元，槲皮素-3’，4-OCHO-，槲皮素吡喃木糖苷和扁蓄苷也是從未報(bào)道的uGT1A9底物。一個(gè)黃酮底物通常產(chǎn)生多個(gè)葡萄糖醛酸苷，但豐度并不相同，表明UGTs酶對(duì)黃酮的多個(gè)羥基存在區(qū)域選擇性催化。LC-MS分析表明，這兩種酶都只能催化形成黃酮的單葡萄糖醛酸苷，而不能形成雙葡萄糖醛酸苷。動(dòng)力學(xué)分析顯示，人類的UGT1A3和UGT1A9更傾向于催化黃酮的苷元而不是糖苷，它們對(duì)大部分黃酮苷元，尤其是黃酮

15、醇，都有較高的催化活性，但是這種催化效率(Vmax/km)隨黃酮苷元的結(jié)構(gòu)改變而改變。UGT1A9的總體催化效率要高于UGT1A3，表明它在黃酮類葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)中的重要作用。 四．UGT1A3變異體的功能及在中國人群中的分布UGTs基因呈高度多態(tài)性。與細(xì)胞色素P450酶系相似，UGTs的遺傳變異也可能導(dǎo)致不同的表型，引起藥物效率和外源物毒性差異。在本實(shí)驗(yàn)中，野生型和變異的人類UGT1A3酶被表達(dá)于Bac-to-Bacr桿狀病

16、毒表達(dá)系統(tǒng)中。我們使用6種廣泛分布的黃酮，槲皮素，木犀草素，山萘酚，水飛薊，桑色素和異鼠李素，作為底物，來檢測(cè)UGTlA3變異體對(duì)黃酮葡萄糖醛酸結(jié)合活性的差異。UGT1A3.4對(duì)所有測(cè)試黃酮的活性都有顯著增加，催化效率(Vmax/km)是野生型UGT1A3.1的3.6～7.8倍。而UGT1 A3.2和UGT1A3.3則導(dǎo)致葡萄糖醛酸結(jié)合活性顯著下降，它們對(duì)于大部分測(cè)試黃酮的活性甚至低于野生型的20％。UGT11A3.5只引起微弱的活性差

17、異。此外，所有變異體對(duì)于槲皮素底物的區(qū)域選擇性變化也被進(jìn)行了研究。UGT1A3.2，UGT1A3.4和UGT1A3.5對(duì)高活性的槲皮素7-和3-葡萄糖醛酸苷的偏好遠(yuǎn)大于野生型，可能使人體對(duì)黃酮的反應(yīng)發(fā)生變化。UGT1A3 45位，47位氨基酸及其附近區(qū)域可能是其活性相關(guān)的重要位點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)也首次確定了UGT1A3各等位基因和幾個(gè)UGT1A3SNPs在中國漢族人群中的分布。部分UGT1A3等位基因和UGT1A3的SNPs在中國漢族