APOB-100 mRNA編輯的細(xì)胞異質(zhì)性研究.pdf

1、載脂蛋白B是低密度脂蛋白(LDL)和乳糜微粒(CM)的必須成分，負(fù)責(zé)甘油三酯和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，其中LDL是人體血漿膽固醇的主要轉(zhuǎn)運(yùn)者。人體內(nèi)主要有兩種形式的載脂蛋白B:Apo B-100和ApoB-48。二者產(chǎn)生自同一基因。ApoB mRNA編輯使ApoB-100 mRNA第6666位上的C變成了U。此處編碼谷氨酰胺的CAA密碼子變成UAA終止密碼子，導(dǎo)致截短的ApoB-48生成。ApoB-48形成的脂蛋白不參與LDL的形成，而更快速地得以

2、清除。血漿LDL的低水平，則降低了基于高LDL-膽固醇的動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)ApoB mRNA編輯的研究，顯然于RNA編輯的機(jī)制及基于高膽固醇導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化癥等方面的探索具有重要意義。
　　目前ApoB mRNA編輯的研究主要是基于特定細(xì)胞類型在RNA水平上的研究，是基于原始細(xì)胞材料的高背景檢測(cè)。且由于RNA提取的不穩(wěn)定、繁瑣等因素，難以實(shí)現(xiàn)RNA編輯的高通量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)利用ApoB mRNA編輯針對(duì)保守序列產(chǎn)生終止密碼子

3、的特征，構(gòu)建了編輯保守序列兩側(cè)分別帶熒光蛋白(DsRed/GFP)基因的ApoB表達(dá)載體，以之轉(zhuǎn)染Caco-2和CBRH-7919細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色和黃色兩種顏色類型，提示編輯發(fā)生細(xì)胞之間存在異質(zhì)性。
　　經(jīng)細(xì)胞分選并對(duì)分選后的兩色細(xì)胞分別培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)綠色細(xì)胞群中出現(xiàn)了黃色細(xì)胞，而黃色細(xì)胞群里也有綠色細(xì)胞出現(xiàn)，提示編輯的細(xì)胞間異質(zhì)性并非來(lái)自遺傳決定機(jī)制，而是由細(xì)胞的動(dòng)態(tài)因素決定的。
　　進(jìn)一步用細(xì)胞周期阻斷劑秋水仙

4、素將細(xì)捕獲在M期，轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞在共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞大多呈綠色，其去除秋水仙素后，繼續(xù)培養(yǎng)30小時(shí)，隨機(jī)觀察發(fā)現(xiàn)綠色細(xì)胞群體中出現(xiàn)了較多黃色的細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀的定量分析，M期捕獲及釋放的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Caco-2和CBRH-7919細(xì)胞黃色細(xì)胞占所有有色細(xì)胞的比例相比較對(duì)照分別下降了14％(p＜0.01)和6％(p＜0.01);而將細(xì)胞從M期中釋放之后，Caco-2和CBRH-7919細(xì)胞黃色細(xì)胞占所有有色細(xì)胞的比例相比較M

5、期捕獲的又顯著增加8.9％(p＜0.01)和16.8％(p＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)了激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。兩種方法共同確證了載脂蛋白B RNA編輯的發(fā)生存在細(xì)胞異質(zhì)性的特點(diǎn)，并指出這種異質(zhì)性來(lái)自于細(xì)胞周期，即載脂蛋白B mRNA在不同細(xì)胞周期中的編輯發(fā)生情況不同。這初步提示了ApoB mRNA編輯發(fā)生的發(fā)育階段特征與細(xì)胞周期有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了高通量ApoB mRNA編輯檢測(cè)體系，能夠根據(jù)顏色的變化直接觀察編輯在