趨化因子SDF-1和fractalkine誘導(dǎo)經(jīng)靜脈注射移植的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血性腦損傷區(qū)的遷移.pdf

1、缺血性腦卒中是嚴(yán)重威脅中老年人健康和生活質(zhì)量的重要疾病，干細(xì)胞移植是促進(jìn)腦損傷修復(fù)和改善神經(jīng)功能的具有實(shí)際應(yīng)用前景的治療手段。作為較理想的供體細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone maiTow stromal cells，BMSCs)移植在實(shí)驗(yàn)性腦缺血的研究中已被證明有明確的保護(hù)作用，但缺血局部微環(huán)境如何促進(jìn)BMSCs趨向病灶遷移的確切機(jī)制仍不明確。趨化因子是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽超家族，基本功能是誘導(dǎo)表達(dá)有相應(yīng)受體的細(xì)胞的定向遷移。有研

2、究提示趨化因子與其受體的作用可能參與促進(jìn)移植的BMSCs在體內(nèi)的定向遷移?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-deftved factor-1，SDF-1)和fractalkine是為數(shù)不多組成性表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的趨化因子。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥、缺血和缺氧等損傷后，病灶周圍SDF-1和fractalkine表達(dá)上調(diào)，分別作用于其特異性受體CXCR4或CX3CR1，可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向病灶的遷移和活化，募集循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)

3、胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，發(fā)揮清除壞死組織和促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs也表達(dá)CXCR4和CX3CR1。由此提示SDF-1/CXCR4和fractalkine/CX3CR1可能參與誘導(dǎo)移植的BMSCs向損傷腦組織的定向遷移，但目前仍缺乏在體研究報(bào)道。本研究旨在觀察SDF-1與其受體CXCR4以及fractalkine與其受體CX3CR1的作用是否參與誘導(dǎo)移植的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal

4、cells，hMSCs)向缺血腦組織的定向遷移，以進(jìn)一步解釋移植BMSCs向腦損傷局部遷移的可能機(jī)制。 方法： 1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈注射移植后向大鼠缺血性腦損傷區(qū)的遷移 以密度梯度離心貼壁篩選法分離純化hMSCs，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行細(xì)胞鑒定；采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)2h缺血/再灌注模型，于再灌注后24h經(jīng)鼠

5、尾靜脈注射移植2×10.hMSCs；于移植后1d、3d和7d，取組織切片行小鼠抗人細(xì)胞核抗體mAb1281免疫組織化學(xué)染色，觀察hMSCs在大鼠體內(nèi)分布情況。 2.大鼠腦缺血后SDF-1和fractalkine表達(dá)的變化 線拴法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)2h缺血/再灌注模型，采用real time PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察腦缺血/再灌注后2d

6、、4d和8d腦組織SDF-1和fractalkine mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 3.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨化因子受體CXCR4和CX3CR1的表達(dá) 分離、純化和擴(kuò)增hMSCs，以real time PCR和western blotting檢測hMSCs趨化因子受體CXCR4和CX3CR1表達(dá)情況；并模擬損傷微環(huán)境部分方面(低氧)培養(yǎng)hMSCs，觀察趨化因子受體CXCR4和CX3CR1表達(dá)的變化。 4.干擾CXCR

7、4和CX3CR1基因表達(dá)對移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血性腦損傷區(qū)遷移的影響 采用可表達(dá)CXCR4或CX3CR1基因特異性siRNA的慢病毒載體病毒顆粒，以MOI=20的載體病毒量感染hMSCs；流式細(xì)胞儀分析測定載體病毒對hMSCs的感染效率；real time PCR和western blotting檢測CXCR4和CX3CR1表達(dá)情況了解載體病毒感染后表達(dá)siRNA的干擾效率；將MCAO模型大鼠分為CX3CR1-RNAi-L

8、V感染hMSCs移植組、CXCR4-RNAi-LV感染hMSCs移植組、陰性病毒感染hMSCs移植對照組和載體溶液注射對照組，每組按照移植后1d、3d和7d不同的時(shí)間點(diǎn)分為3個(gè)亞組，各組大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)行全身灌注固定，觀察hMSCs(GFP陽性細(xì)胞)在腦組織的分布情況。 結(jié)果： 1.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈注射移植后向大鼠缺血性腦損傷區(qū)的遷移 hMSCs呈長梭形、漩渦狀生長，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD2

9、9和CD105陽性，CD14和CD45陰性；線拴法制作MCAO大鼠，術(shù)后Zea Longa五分制評分2～3分，TTC染色可見白色梗死區(qū)；hMSCs靜脈移植后，在缺血/再灌注損傷側(cè)腦組織中可觀察到大量mAb1281陽性細(xì)胞，主要分布于缺血病灶周圍區(qū)；在心、肝、脾、肺和腎等臟器以及損傷對側(cè)腦組織中僅可觀察到少量mAb1281陽性細(xì)胞散在分布。 2.大鼠腦缺血后SDF-1和fractalkine表達(dá)的變化 腦缺血/再灌注損傷2

10、d、4d和8d組大鼠缺血側(cè)大腦腦組織SDF-1 mRNA表達(dá)分別為正常對照組的2.285倍、2.543倍和1.710倍；fractalkine mRNA表達(dá)分別為正常對照組的1.154倍、2.453倍和1.341倍。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)正常組大鼠腦組織中有SDF-1和fractalkine陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞散在分布于皮質(zhì)、紋狀體等部位；腦缺血/再灌注損傷組大鼠腦組織SDF-1和fractalkine陽性細(xì)胞明顯增多，損傷后2d、4d和8

11、d組大鼠腦組織梗死灶周圍區(qū)聚集大量SDF-1和fractalkine陽性細(xì)胞：SDF-1表達(dá)平均光密度由正常對照組的6.02±0.37，分別增高為37.8±1.30(2d組)、44.8±2.21(4d組)和30.6±1.08(8d組)；fractalkine平均光密度由正常對照組的5.77±0.57，分別增高為31.3±1.80(2d組)、43.1±7.63(4d組)和30.2±4.18(8d組)。 3.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨化因

12、子受體CXCR4和CX3CR1的表達(dá) CXCR4和CX3CR1免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)分布于hMSCs的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿：hMSCs在常規(guī)培養(yǎng)條件下有CXCR4和CX3CR1 mRNA表達(dá)，低氧條件下CXCR4和CX3CR1表達(dá)增高，分別為常規(guī)培養(yǎng)條件下的2.162倍(P<0.01)和2.524倍(P<0.05)；western blotting檢測發(fā)現(xiàn)hMSCs在正常培養(yǎng)條件下有CXCR4和CX3CR1表達(dá)，低氧條件下CXCR

13、4和CX3CR1表達(dá)顯著增高：CXCR4表達(dá)由正常組的0.535±0.061增高為0.901±0.029(P<0.01)，CX3CR1表達(dá)由正常組的0.360±0.079增高為0.716±0.102(P<0.05)。 4.干擾CXCR4和CX3CR1基因表達(dá)對移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血性腦損傷區(qū)遷移的影響 流式細(xì)胞分析慢病毒載體對hMSCs感染效率均高于90％。陰性病毒感染組hMSCsCXCR4和CX3CR1 mRNA

14、表達(dá)與正常未感染組hMSCs比較無顯著差異(P>0.05)；CXCR4-RNAi-LV感染組hMSCs CXCR4 mRNA表達(dá)與正常未感染組hMSCs比較下降82.6％(P<0.01)；CX3CR1-RNAi-LV感染組hMSCs CX3CR1 mRNA表達(dá)與正常未感染組hMSCs比較下降了74.4％(P<0.01)。western blotting檢測發(fā)現(xiàn)陰性病毒感染組和正常未感染組CXCR4和CX3CR1表達(dá)無顯著差異；CXCR4

15、-RNAi-LV感染組較正常未感染組CXCR4表達(dá)下降80.0％(P<0.05)，CX3CR1-RNAi-LV感染組較正常未感染組CX3CR1表達(dá)下降71.7％(P<0.05)。各組大鼠腦組織中均可觀察到GFP陽性細(xì)胞，主要分布于缺血側(cè)大腦半球病灶周圍區(qū)；CXCR4一RNAi-LV感染hMSCs移植組和CX3CR1-RNAi-LV感染hMSCs移植組與陰性病毒感染hMSCs移植對照組相比，移植后1d、3d和7d，腦組織中GFP陽性細(xì)胞數(shù)

16、量均顯著減少(P<0.01)。 結(jié)論： 1.靜脈注射移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血性腦損傷區(qū)定向遷移； 2.缺血性腦損傷區(qū)趨化因子SDF-1和fractalkine表達(dá)增高； 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)趨化因子SDF-1受體CXCR4和fractalkine受體CX3CR1； 4.干擾SDF-1受體CXCR4或fractalkine受體CX3CR1的基因表達(dá)后，移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血性腦損傷區(qū)的