骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能改變及早期干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分：骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)變化及二磷酸鹽的干預(yù)效應(yīng)
　　目的：觀察兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)變化及二磷酸鹽的干預(yù)作用，以探討骨性關(guān)節(jié)炎(OA)早期軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)的變化在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對(duì)照組（n=12）。采用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。分三組：二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，

2、Risedronate sodium）0.01mg/kg體重；模型組和對(duì)照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術(shù)后分別于4W、8W、12 W各時(shí)相點(diǎn)分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對(duì)照組（n=4）。分別切取保留關(guān)節(jié)面上下各2cm骨的手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，清除軟組織，后行Micro-CT檢查。得具體測(cè)量參數(shù)：骨體積分?jǐn)?shù)(BVF),、骨小梁厚度Tb.Th)、骨小梁間隔(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、體積骨密度(vB

3、MD)、組織骨密度（tBMD），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：模型組、二磷酸鹽組、對(duì)照組不同時(shí)期的骨密度及軟骨下骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化。顯示術(shù)后第4W三組比較，模型組體積分?jǐn)?shù)（BVF）、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度（Tb.Th）比對(duì)照組明顯降低，P<0.01；體積分?jǐn)?shù)(BVF)比二磷酸鹽組也降低P<0.05；BVF二磷酸鹽組與對(duì)照組比亦降低,P<0.05；骨小梁分離度（Tb.Sp）模型組比二磷酸鹽及對(duì)照組均增大,P<0.01。二磷

4、酸鹽組比對(duì)照組明顯增大,P<0.01。骨密度模型組比二磷酸鹽及對(duì)照組明顯降低,P<0.05。而二磷酸鹽組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05。12周時(shí)三組比較，模型組體積分?jǐn)?shù)（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目(Tb.N)比二磷酸鹽及對(duì)照組明顯增加,P<0.05。骨小梁分離度明顯減少,P<0.05。而骨密度顯著增加,P<0.01。我們對(duì)不同時(shí)期相關(guān)微結(jié)構(gòu)參數(shù)也進(jìn)行了比較,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。4周時(shí)和12周時(shí)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)及骨密度變化情

5、況比較，骨體積分?jǐn)?shù)，骨小梁厚度，骨小梁數(shù)目明顯增加,P<0.01。骨小梁分離度明顯減小,P<0.01。12周時(shí)的骨密度較4周時(shí)顯著增加,P<0.01。
　　結(jié)論：膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)明顯的骨重塑。早期以骨破壞為主，各種骨量及骨結(jié)構(gòu)指標(biāo)均下降。后期出現(xiàn)明顯的骨形成，各種骨量及骨結(jié)構(gòu)指標(biāo)均增加。二磷酸鹽可通過(guò)抗骨吸收明顯抑制軟骨下骨的骨重塑，緩解骨質(zhì)破壞和吸收，保護(hù)軟骨下骨的骨結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)軟骨下骨的力學(xué)性

6、能，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。軟骨下骨三維結(jié)構(gòu)的改變?cè)贠A發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　第二部分：骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨力學(xué)性能變化有限元分析及二磷酸鹽的干預(yù)效應(yīng)
　　目的：觀察兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨力學(xué)性能的改變及二磷酸鹽的干預(yù)作用，以探討骨性關(guān)節(jié)炎(OA)早期軟骨下骨力學(xué)性能的改變?cè)贠A發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機(jī)數(shù)字表法60只新西蘭大白兔隨機(jī)分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24

7、）,對(duì)照組（n=12）。采用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉， Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對(duì)照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術(shù)后分別于4W、8W、12W各時(shí)相點(diǎn)分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對(duì)照組（n=4）。分別切取保留關(guān)節(jié)面上下各2cm骨的手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，清除軟組織，進(jìn)行大體評(píng)分。后行Micro-CT檢查。從

8、Micro-CT得到DICOM式的二維圖像文件。將獲得的DICOM導(dǎo)入Mimics V10.01軟件中進(jìn)行擬合，并導(dǎo)入到Ansys V10中進(jìn)行有限元處理。得到關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin評(píng)分；通過(guò)Micro-CT對(duì)60個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢查，得到體積分?jǐn)?shù)（BVF）、骨小梁厚度（Tb.Th）骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨密度（BMD）有限元軟件計(jì)算得到彈性模量(EM)，反應(yīng)力(RF)，平均Von Mises應(yīng)力。后進(jìn)行統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)分析比較。
　　結(jié)果：兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)造模術(shù)后4W時(shí)，模型組、二磷酸鹽組、對(duì)照組三組比較體積分?jǐn)?shù)、彈性模量、反應(yīng)力、平均Von Mises應(yīng)力參數(shù)均下降，模型組比二磷酸鹽組、對(duì)照組低, P<0.01。二磷酸鹽組與對(duì)照組也下降，但P>0.05。骨密度模型組比二磷酸鹽及對(duì)照組明顯降低，而二磷酸鹽組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。12W時(shí)模型組體積分?jǐn)?shù)（BVF）、骨密度（BMD）明顯增加, P<0.01。彈性模量、反應(yīng)力， Von

10、 Mises應(yīng)力較對(duì)照組和二磷酸鹽組低;二磷酸鹽組亦較對(duì)照組低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義， P>0.05。4W與12W時(shí)，BVF、BMD、彈性模量、反應(yīng)力，Von Mises應(yīng)力均升高P>0.01。并進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果顯示術(shù)后4周，彈性模量與Mankin評(píng)分相關(guān)系數(shù)r=―0.835，（P<0.01）,有顯著相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)。與骨密度相關(guān)系數(shù)r=0.848，（P<0.01）有顯著相關(guān)性，呈正相關(guān)。與體積分?jǐn)?shù)相關(guān)系數(shù)r=0.893，（P<0.01）,

11、有顯著相關(guān)性，呈正相關(guān)。12W時(shí)，彈性模量與Mankin評(píng)分相關(guān)系數(shù)r=―0.883，（P<0.01）,有顯著相關(guān)性，呈負(fù)相關(guān)。與骨密度相關(guān)系數(shù) r=0.861，（P<0.01），有顯著相關(guān)性，呈正相關(guān)；彈性模量與體積分?jǐn)?shù)相關(guān)系數(shù)r=0.817，（P<0.01）,有顯著相關(guān)性，呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨發(fā)生力學(xué)性能改變，早期彈性模量明顯降低，后期升高。同時(shí)彈性模量和軟骨下骨的 BMD、體積分?jǐn)?shù)及關(guān)節(jié)軟骨的 Man

12、kin評(píng)分密切相關(guān)。二磷酸鹽可通過(guò)抗骨吸收明顯提高軟骨下骨的彈性模量，表明關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨力學(xué)性能的改變可能和異常應(yīng)力引起的骨吸收有關(guān)。軟骨下骨力學(xué)性能的改變?cè)贠A發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　第三部分：兔膝骨關(guān)節(jié)炎早期軟骨下骨血管再生變化及二磷酸鹽干預(yù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：觀察兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期關(guān)節(jié)軟骨改變和軟骨下骨血管再生變化以及二磷酸鹽的保護(hù)作用，探討OA早期關(guān)節(jié)軟骨改變和軟骨下骨血管再生變化之間的關(guān)系以及軟骨下

13、骨在OA中的作用。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機(jī)數(shù)字表法60只新西蘭大白兔隨機(jī)分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對(duì)照組（n=12）。采用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉，Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對(duì)照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術(shù)后分別于4W、8W、12W各時(shí)相點(diǎn)分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8

14、），二磷酸鹽組（n=8）,對(duì)照組（n=4）。分別切取保留關(guān)節(jié)面上下各2cm骨的手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，清除軟組織，進(jìn)行大體評(píng)分。通過(guò)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨表面形態(tài)觀察及 HE染色觀察,進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin評(píng)分。同時(shí)對(duì)軟骨下骨骨軟骨連接處的血管密度進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過(guò)計(jì)算穿過(guò)骨軟骨連接處的血管數(shù)目來(lái)確定血管密度，亦即接觸或穿過(guò)潮線的血管數(shù)目。并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　結(jié)果：4W時(shí)模型組出現(xiàn)2例出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液和滑膜增生，關(guān)節(jié)面糜爛、粗糙；8w時(shí)2例出現(xiàn)積液及

15、滑膜增生，滑液輕度混濁，軟骨改變集中在股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面，軟骨軟化，關(guān)節(jié)面發(fā)黃纖維化明顯，有大的縫隙出現(xiàn)；12w時(shí)滑膜結(jié)節(jié)樣增生，滑液混濁，有2例股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面出現(xiàn)了大的裂縫和潰瘍，并且見(jiàn)到骨贅。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示4w時(shí)模型組與二磷酸鹽組、對(duì)照組比較，已出現(xiàn)軟骨退變（P<0.01），8、12w時(shí)退變進(jìn)一步加重（P<0.01）。而12w退變明顯比4W時(shí)嚴(yán)重，（P<0.01）。對(duì)照側(cè)多為正常關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)，Mainkin評(píng)分0-

16、1分。HE染色顯示，模型組和二磷酸鹽組關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin評(píng)分在兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)4w時(shí)模型組與二磷酸鹽組、對(duì)照組比較，已出現(xiàn)軟骨退變（P<0.01），8、12w時(shí)退變進(jìn)一步加重（P<0.01）。而12w退變明顯比4w時(shí)嚴(yán)重，（P<0.01）。顯示，股骨內(nèi)外髁骨軟骨交界區(qū)的血管侵犯在OA早期與對(duì)照組相比明顯增加（P<0.01）,8w、12w和4w有明顯差別（P<0.01），股骨外髁8w時(shí)明顯增加（P<0.01），股骨內(nèi)髁比股骨外髁在每個(gè)時(shí)

17、間點(diǎn)有明顯增多（P<0.01）。對(duì)股骨內(nèi)外髁不同組之間的骨軟骨連接區(qū)的血管侵犯的密度也進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），模型組與用藥組明顯差別(P<0.01）。
　　結(jié)論：膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期關(guān)節(jié)軟骨開(kāi)始退變，軟骨下骨與關(guān)節(jié)軟骨交界區(qū)血管增生。二磷酸鹽對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抑制血管增生，抗骨吸收改善關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨的力學(xué)性能有關(guān)。關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨是一個(gè)相互聯(lián)系的統(tǒng)一體，軟骨下

18、骨在OA的發(fā)病中可能有著更為重要的作用。
　　第四部分：兔骨關(guān)節(jié)炎模型早期關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨生化改變及二磷酸鹽的干預(yù)效應(yīng)
　　目的：觀察兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、軟骨下骨基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和組織蛋白酶K(CK)的表達(dá)變化及二磷酸鹽的抑制作用，進(jìn)一步證明OA早期軟骨下骨存在骨吸收，并探討其機(jī)制及其二磷酸鹽的作用途徑。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔60只，隨機(jī)數(shù)字表法60

19、只新西蘭大白兔隨機(jī)分成三組，模型組（n=24）,二磷酸鹽組（n=24）,對(duì)照組（n=12）。采用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型（切斷前交叉韌帶）右膝造模。二磷酸鹽組每天皮下注射二磷酸鹽（利塞磷酸鈉， Risedronate sodium）0.01mg/kg體重，模型組和對(duì)照組給予等體積的生理鹽水皮下注射。術(shù)后分別于4W、8W、12W各時(shí)相點(diǎn)分別空氣栓塞處死兔子，模型組（n=8），二磷酸鹽組（n=8）,對(duì)照組（n=4）。在各個(gè)時(shí)相點(diǎn)模型組和二磷酸鹽組各取

20、8個(gè)右膝關(guān)節(jié)，對(duì)照組取4個(gè)右膝關(guān)節(jié)的股骨內(nèi)側(cè)髁，用SP免疫組化染色方法分別檢測(cè)各組在4W和12W時(shí)關(guān)節(jié)軟骨MMP-13、軟骨下骨MMP-9和CK表達(dá)變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。
　　結(jié)果：兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)造模4W時(shí)各組都有MMP-13、MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。對(duì)照組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞較少，模型組陽(yáng)性細(xì)胞較多。對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽(yáng)性表達(dá)率分別為4.17%、10%和95%；對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽(yáng)

21、性表達(dá)率分別為4%、12.5%和90%；CK陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33%、12.5%和90%。與對(duì)照組比較，模型組有顯著性差異(P<0.01)，而二磷酸鹽組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。二磷酸鹽能明顯減少M(fèi)MP-13、MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)；與模型組比較，有顯著性差異(P<0.01)。兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)造模8W時(shí)各組都有MMP-13、MMP-9和CK陽(yáng)性表性差異滬>0.05 )。二磷酸鹽能明顯減少M(fèi)MP-13, MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

22、對(duì)照組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞較少，模型組陽(yáng)性細(xì)胞較多。對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33% , 12.5%和95%，對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33% , 12.5%和87.5%；CK陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33%,12.5%和85%。與對(duì)照組比較，模型組有顯著性差異(P<0.01),而二磷酸鹽組無(wú)顯著性差異((P>0.05)。二磷酸鹽能明顯減少M(fèi)MP-13, MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)

23、;與模型組比較，有顯著性差異(P<0.01)。兔膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)造模12W時(shí)各組都有MMP-13, MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。對(duì)照組和二磷酸鹽組陽(yáng)性細(xì)胞較少，模型組陽(yáng)性細(xì)胞較多。對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-13陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.0%,12.5%和77.5%，對(duì)照組、二磷酸鹽組和模型組MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33%，15%和77.5%；CK陽(yáng)性表達(dá)率分別為8.33%,12.5%和75%。與對(duì)照組比較，模型組有顯著性差異(P<0

24、.01)，而二磷酸鹽組無(wú)顯著性差異(P>0.05 )。二磷酸鹽能明顯減少M(fèi)MP-13, MMP-9和CK陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞;與模型組比較有顯著性差異((P<0.01)。模型組MMP-9和CK陽(yáng)性數(shù)目和陽(yáng)性表達(dá)率在12W較4W時(shí)顯著降低(P<0.05 )。
　　結(jié)論：膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)早期軟骨下骨骨吸收明顯，MMP-9和CK明顯增高是其原因之一。隨著OA的進(jìn)展，骨吸收作用逐漸減弱。二磷酸鹽的抗骨吸收作用與其抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生的MMP-9和CK有關(guān)。