三種免疫細(xì)胞聯(lián)合治療結(jié)直腸癌的臨床效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:盡管結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較其他消化道腫瘤好,但仍有相當(dāng)一部分病例術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。手術(shù)只能清除肉眼所見腫塊,放療及化療也不能將腫瘤細(xì)胞斬盡殺絕,這三種傳統(tǒng)治療方法的實(shí)施均對機(jī)體的抗腫瘤免疫功能造成一定的抑制和損傷。而免疫治療作為新興的腫瘤治療的第四大手段已經(jīng)在實(shí)體腫瘤治療中使患者受益。荷載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞(DendriticCells,DCs)、樹突狀細(xì)胞致敏的T淋巴細(xì)胞(DC-activatedT,DC-AT)和活化的T淋巴

2、細(xì)胞(activatedTcells,ATC)作為免疫治療的重要部分,已經(jīng)在臨床治療中得到應(yīng)用,但聯(lián)合三種免疫細(xì)胞在圍手術(shù)期通過不同路徑不同時(shí)間序貫回輸體內(nèi)治療結(jié)直腸癌未見臨床報(bào)道。T淋巴細(xì)胞作為三種免疫細(xì)胞聯(lián)合治療的主要效應(yīng)細(xì)胞,可特異性識別腫瘤,呈克隆化擴(kuò)增,并在體內(nèi)形成免疫記憶,可介導(dǎo)持久抗腫瘤特異性免疫。關(guān)于T淋巴細(xì)胞回輸人體內(nèi)后通過克隆化擴(kuò)增和形成免疫記憶來重建抗腫瘤特異性免疫的相關(guān)機(jī)制亦是未見報(bào)道。
　　目的:通過前瞻

3、性臨床隊(duì)列研究觀察三種免疫細(xì)胞聯(lián)合治療結(jié)直腸癌的臨床效應(yīng),建立動態(tài)觀察結(jié)直腸癌患者免疫治療前及治療后T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)CDR3(Complementarydeterminingregion,CDR)區(qū)基因克隆化程度和T淋巴細(xì)胞免疫記憶狀態(tài)的技術(shù)平臺,評價(jià)特異性抗腫瘤免疫功能重建程度,探討免疫細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的長效機(jī)制。
　　方法:1)選取2005年7月至2011年7月解放軍總醫(yī)院253例行結(jié)直腸癌根治術(shù)

4、的II、III和IV期患者,按照治療方式不同,將181例單純術(shù)后輔助化療患者設(shè)為對照組,72例術(shù)后輔助化療聯(lián)合DCs、DC-AT和ATC免疫治療患者設(shè)為免疫治療組。對兩組患者定期隨訪,截至于2012年7月。采用Kaplan–Meier生存分析法比較兩組5年生存率并繪制生存曲線,進(jìn)一步分析免疫治療頻次對免疫治療療效的影響,并觀察免疫細(xì)胞治療過程中有無不良反應(yīng)。2)選取3例進(jìn)行免疫治療的結(jié)直腸癌患者,采集免疫治療前及治療后3個(gè)月的外周血。以

5、流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中央型記憶T細(xì)胞和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞比例,評估免疫治療后體內(nèi)形成的T細(xì)胞免疫記憶狀態(tài);用磁珠從外周血分離的PBMC中分離CD4+、CD8+T細(xì)胞,分別提取CD4+/CD8+T細(xì)胞中RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用TCRCDR3多態(tài)性及克隆化可視化和定量化檢測技術(shù)對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR,對產(chǎn)物進(jìn)行基因掃描,獲得免疫治療前后TCRCDR3基因掃描譜;同時(shí)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,獲得TCRCDR3基因電泳譜,選取免疫治療前后持續(xù)表

6、達(dá)的Vβ2和治療后出現(xiàn)的Vβ11單克隆條帶進(jìn)行切膠純化;將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆及細(xì)菌轉(zhuǎn)化,通過藍(lán)白篩選活的克隆菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,對含有目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行基因測序,采用VectorNTIversion11和IMGT/V-QUEST對序列進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:1)免疫治療組3年和5年生存率較對照組均顯著升高(87.07％VS74.80%;75.63%VS67.81%,P<0.05)。2)免疫治療組中治療頻次≥3個(gè)周期患者5年

7、生存率較<3個(gè)周期的患者顯著升高(82.10%VS69.90%,P<0.05)。3)免疫細(xì)胞治療前(亦是手術(shù)前荷瘤狀態(tài))外周血TCRCDR3基因譜顯示:3例結(jié)直腸癌患者均表達(dá)CD8+TCRVβ2、Vβ3、Vβ5、Vβ8和Vβ22單克隆基因條帶,表明初診時(shí)結(jié)直腸癌患者體內(nèi)預(yù)存特異性抗腫瘤克隆化T細(xì)胞。4)對比分析免疫細(xì)胞治療前及治療后的CD8+TCRCDR3基因譜顯示:3例結(jié)直腸癌患者治療前后持續(xù)共表達(dá)單克隆Vβ2,而Vβ3、Vβ5、Vβ

8、8和Vβ22則呈現(xiàn)恢復(fù)多態(tài)性趨勢,說明結(jié)直腸癌患者本身存在特異性的抗腫瘤克隆化T細(xì)胞,免疫細(xì)胞治療后預(yù)存免疫狀態(tài)得以保持。治療后3例患者均出現(xiàn)了單克隆Vβ11,即免疫細(xì)胞治療誘導(dǎo)產(chǎn)生了新的克隆化T細(xì)胞。5.免疫治療后結(jié)直腸癌患者外周血中CD8+中央型記憶T細(xì)胞比例較治療前顯著升高,即抗腫瘤特異性T細(xì)胞比例顯著升高。5)3例結(jié)直腸癌患者外周血TCRVβ2克隆化CDR3區(qū)第1-3位共表達(dá)氨基酸序列為CSA,而Vβ11共表達(dá)氨基酸序列為CAS