常染色體顯性多囊腎疾病行胚胎植入前遺傳學診斷的方法研究.pdf

1、目的： 常染色體顯性多囊腎疾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳病之一，人群中的發(fā)病率為1/1000，是發(fā)病率最高的遺傳性腎病，居我國終末期腎衰竭病因的第4位。 引起ADPKD的突變基因有PKD1和PKD2，現(xiàn)認為可能存在PKD3。PKD1是最常見的致病基因，定位于染色體16p13.3，基因長度為47kb，含有46個外顯子。PK

2、D2基因定位于染色體4q21-23，基因長度為70 kb，含有15個外顯子。PKD1和PKD2的蛋白產(chǎn)物為多囊蛋白，其異常是導(dǎo)致多個臟器特別是腎臟進展性等多囊性改變的主要原因。ADPKD的主要表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟形成多個液性囊泡，囊腫進行性增大，造成腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害，最終引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。除了腎臟病變外，還累及全身多個器官，如肝囊腫、高血壓、顱內(nèi)動脈瘤、心瓣膜畸形等，因此ADPKD

3、是一種全身性疾病。目前對ADPKD的治療尚無特異的治療措施，只是一些對癥治療和延緩多囊腎病向ESRD進展的干預(yù)措施，多數(shù)患者最終將發(fā)展到終末期腎衰而不得不進行腎臟替代治療和腎移植手術(shù)。 由于ADPKD延遲性發(fā)病的特點，平均發(fā)病年齡在40歲左右，其突變基因攜帶者在婚育年齡可能尚未發(fā)病，因此ADPKD攜帶者常低估ADPKD的遺傳風險。由于ADPKD呈常染色體顯性遺傳，事實上50％的后代有ADPKD的遺傳風險。近年來，胚胎植入前遺傳學

4、診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)已被成功應(yīng)用于ADPKD。PGD做為一種比傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷更早的診斷方法，對配子或著床前的胚胎進行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒有異常遺傳物質(zhì)的胚胎進行移植，既能防止患兒的產(chǎn)生，又能避免治療性流產(chǎn)和引產(chǎn)給夫婦雙方帶來生理和心理上的創(chuàng)傷。 由于PKD1和PKD2基因龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有較多的重復(fù)序列，突變的種類多，可能涉及整個基因，沒有突變熱點，因此進行直接突變檢測

5、較為困難。本研究主要利用與PKD1緊密連鎖的KG8、SM6、CW4、CW2和與PKD2連鎖的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423等8個微衛(wèi)星作為遺傳標記，先對多囊腎家系進行遺傳學分析，找出與致病基因連鎖的微衛(wèi)星，而后用該微衛(wèi)星對廢棄胚胎的微衛(wèi)星分型結(jié)果進行分析，以建立PKD1所致的ADPKD的胚胎植入前遺傳學診斷方法。 方法： 1、獲取3個多囊腎家系成員的外周血，提取DNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)和毛細管

6、電泳對多囊腎家系成員進行STR(short tandem repeats，STR)分型，包括與PKD1緊密連鎖的KG8、SM6、CW4、CW2和與PKD2連鎖的D4S1534、D4S1563、D4S414、D4S423的8個微衛(wèi)星，通過基因連鎖分析，找出與致病基因連鎖的微衛(wèi)星。對其中1個家系在行常規(guī)體外受精胚胎移植后的不適宜移植和冷凍的廢棄胚胎5個共15個卵裂球進行了STR分型。 2、對2個志愿者提供的共64個淋巴細胞利用四重巢

7、式PCR和毛細管電泳對KG8、SM6、CW4和CW2四個位點進行STR分型。 結(jié)果： 1、建立家系系譜圖，遵照孟德爾遺傳規(guī)律進行基因連鎖分析發(fā)現(xiàn)，3個家系發(fā)病均由PKD1突變所致。 2、在家系的分析中，A-Ⅱ-1、A-Ⅱ-3、A-Ⅱ-4、A-Ⅱ-6、A-Ⅲ-1、B-Ⅱ-3、C-Ⅱ-1、C-Ⅱ-3和C-Ⅲ-1共9個SM6的STR分型結(jié)果和卵裂球的SM6的STR分型結(jié)果均不能由親代推導(dǎo)出，A-Ⅱ-3的D4S1563同

8、樣也發(fā)生了類似的現(xiàn)象，其余6個微衛(wèi)星位點均出現(xiàn)此類情況?？紤]到SM6測序結(jié)果的不穩(wěn)定性，其可能不適合作為ADPKD的連鎖標記。 3、5個廢棄胚胎的15個卵裂球9個行四重巢式PCR，7個擴增成功，6個行雙重巢式PCR，均擴增成功，擴增成功率為86.67％(13/15)，未發(fā)現(xiàn)污染，SM6結(jié)果不能由親代推導(dǎo)出，有3個卵裂球的KG8位點出現(xiàn)ADO，而CW4與CW2未出現(xiàn)ADO。兩個胚胎攜帶致病基因。 4、單個淋巴細胞擴增成功率

9、為85.93％(55/64)，SM6擴增成功率為89.06％(57/64)，CW4擴增成功率為92.18％(59/64)，CW2擴增成功率為89.06％(57/64)，KG8位點的ADO率為25.64％(10/39)，CW4位點的ADO率為25％(4/16)，CW2位點的ADO率為7.01％(4/57)，均未發(fā)現(xiàn)污染。 5、單個卵裂球和單個淋巴細胞的CW2的STR結(jié)果均有酶鏈滑脫現(xiàn)象。 結(jié)論： 1、通過本研究，微

10、衛(wèi)星KG8、CW4、CW2、D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423可作為遺傳標記對多囊腎家系進行基因連鎖分析，本研究中單細胞四重巢式PCR擴增成功率高，污染率低，等位基因脫扣率低，該方法為與PKD1連鎖的常染色體顯性多囊腎疾病的胚胎植入前遺傳學診斷提供了可靠的依據(jù)。 2、SM6基因的STR測序結(jié)果的不穩(wěn)定性和微衛(wèi)星CW2的酶鏈滑脫現(xiàn)象有待進一步研究。 3、通過該實驗研究，我們可以考慮為另兩個家系做胚胎