神經(jīng)生長因子高親和力受體TrkA-真核翻譯起始因子4A1(eIF4A1),干擾素-λ受體1(IFN-λR1)-腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用的分子機(jī)制及功能研究.pdf

1、第一部分：神經(jīng)生長因子高親和力受體TrRA與真核翻譯起始因子4A1(eIF4A1)相互作用的分子機(jī)制及功能研究
　　 神經(jīng)營養(yǎng)素是一個(gè)由多個(gè)相關(guān)蛋白組成的家族，最初是作為感覺和交感神經(jīng)元的存活因子被鑒定出來，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以調(diào)控神經(jīng)元的存活、發(fā)育和功能等諸多方面。在哺乳動(dòng)物中有4類神經(jīng)營養(yǎng)素：神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)素-4/5(NT4/5)。神

2、經(jīng)營養(yǎng)素主要通過兩種類型的膜受體傳遞信號(hào)到胞內(nèi)，它們分別是原肌球蛋白相關(guān)激酶(tropomyosin-related kinase，Trk)酪氨酸激酶受體以及p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75NTR)。每種神經(jīng)營養(yǎng)素，可以激活受體酪氨酸激酶原肌球蛋白相關(guān)激酶家族中的三個(gè)成員(TrkA、TrkB、TrkC)中的一個(gè)或多個(gè)。此外，每種神經(jīng)營養(yǎng)素都可激活p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體。通過Trk受體，神經(jīng)營養(yǎng)素激活Ras、磷脂酰肌醇3激酶、磷脂酶C-γ1以及

3、這些蛋白調(diào)控的信號(hào)通路，如MAP激酶。
　　 真核翻譯起始因子eIF4F(eukaryotic translation initiation factor 4F)是蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)將核糖體募集到mRNA上。該復(fù)合物由eIF4A(RNA依賴的ATPase和RNA解旋酶)、eIF4E（帽結(jié)合蛋白）和eIF4G（腳手架蛋白）三個(gè)亞單位組成。eIF4A是ATP依賴的RNA解旋酶，負(fù)責(zé)打開mRNA5’端非編碼順序的次級(jí)結(jié)構(gòu)以便核糖體的募集

4、。eIF4A家族成員有3個(gè)，eIF4A1、eIF4A2和eIF4A3。eIF4A是一些分子如Pdcd4、PatemineA、多羥基瑙醇、15d-PGJ2、BC1RNA等抑制翻譯起始的靶點(diǎn)。
　　 在我們的前期研究工作中證實(shí)了p75NTR和TrkA均能與RanBPM相互作用，三者形成一個(gè)復(fù)合物而TrkA抗體對(duì)真核細(xì)胞裂解液的免疫沉淀復(fù)合物的電泳分離和質(zhì)譜分析得到了TrkA胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain of Tr

5、kA，TrkAICD)的新的相互作用蛋白-eIF4A1，本論文將在此基礎(chǔ)上深入研究TrkA與eIF4A1的相互作用的分子機(jī)制及功能。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：
　　 1.酵母雙雜交、GSTpull-down、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)TrkAICD能與eIF4A1相互作用。
　　 2.eIF4A1主要通過N端與TrkAICD相互作用；而TrkAICD通過酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(TK)與eIF4A1相互作用。
　　

6、3.GSTpull-down、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)TrkA能與eIF4A1相互作用。
　　 4.體內(nèi)翻譯實(shí)驗(yàn)證實(shí)TrkA能促進(jìn)5t端帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯。
　　 5.體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)eIF4A1能降低TrkA受體的泛素化。
　　 第二部分：干擾素九受體1(IFN-λR1)與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用及功能研究
　　 IFN-λ是最近新發(fā)現(xiàn)的一種IFNs，被干擾素和細(xì)胞因子研究

7、國際學(xué)會(huì)命名委員會(huì)命名為Ⅲ型IFNs。IFN-λ家族包括三個(gè)成員：IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3（也分別稱為IL-29、IL-28A、IL-28B）。IFN-λ通過其受體IFN-λR發(fā)揮作用。IFN-λR屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族，由兩個(gè)亞基構(gòu)成：CRF2-12(也稱為IFN-λR1)和CRF2-4。IFN-λR1是IFN-λR特有的亞基。CRF2-4同時(shí)也是L-10、IL-22、IL-26受體的組成部分。IFN-λR的兩個(gè)亞基

8、在人體的多種細(xì)胞系和組織中都有表達(dá)，通過JAK-STAT通路傳導(dǎo)信號(hào)。IFN-λ與受體結(jié)合后，具有抗病毒和其它的生物學(xué)活性，其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與Ⅰ型IFNs相似。
　　 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necorsis factor receptor associated factors，TRAFs)是細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白，能夠?qū)NFR超家族成員的胞內(nèi)區(qū)的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。目前，哺乳動(dòng)物TRAFs家族有七個(gè)成員（TRAF1-TR

9、AF7）。在TRAFs家族中，TRAF6與眾不同，它具有獨(dú)特的受體結(jié)合特異性，TRAF6是兩個(gè)研究小組獨(dú)立克隆出來的。一個(gè)小組通過查找TRAF2樣序列的DNA數(shù)據(jù)庫，然后通過cDNA文庫篩選得到的。另一個(gè)小組是將CD40作為誘餌，通過酵母雙雜交篩選得到的。TRAF6是IL-1R/TLR家族和TNFR超家族的重要接頭分子，能調(diào)節(jié)包括先天性免疫、獲得性免疫、骨代謝在內(nèi)的多個(gè)生理過程。
　　 在前期的工作中，我們已經(jīng)通過GSTpull

10、-down和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IFN-λR1的胞內(nèi)區(qū)能與TRAF6相互作用。為了研究IFN-λR1全長和TRAF6的相互作用，我們進(jìn)行了外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和半內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。為了研究IFN-λR1全長和TRAF6相互作用的功能及所涉及到的信號(hào)通路，我們進(jìn)行了NF-κB啟動(dòng)子實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)。
　　 在研究中，我們發(fā)現(xiàn)：
　　 1．外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和半內(nèi)源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IFN-λR1全長和TRAF6