補陽還五顆粒有效部位質(zhì)量控制及藥效研究.pdf

1、目的:
　　本研究課題以科學(xué)合理的改進優(yōu)化和完善補陽還五湯中有效部位的制備工藝，并進行以有效部位提取物重新組方的“補陽還五顆?！钡乃幮W(xué)實驗研究為主要目標(biāo)，通過測定缺血性腦中風(fēng)模型大鼠在給藥前、后腦內(nèi)阿片肽類物質(zhì)，即血漿中強啡呔Al-β樣免疫活性物質(zhì)（ir-DynAl-β），神經(jīng)肽Y(NPY)的水平;血液因子類物質(zhì):β-血栓球蛋白(β-TG)，血小板因子4(PF-4)的水平;血液流變學(xué)指標(biāo)，包括:血沉、纖維蛋白原、紅細胞壓積、全血

2、粘度、血漿粘度、全血還原粘度、紅細胞電泳時間等的變化;觀察大鼠大腦海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以腦心通膠囊（步長制藥有限公司）作為陽性對照藥，來觀察、驗證新型補陽還五顆粒對缺血性腦中風(fēng)的療效。
　　同時采用昆明小鼠做急性毒性實驗，重新再觀察新型補陽還五顆粒的安全性，為臨床安全用藥提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法:
　　（一）補陽還五湯有效部位提取物的質(zhì)控及其復(fù)方顆粒的制備研究根據(jù)補陽還五湯復(fù)方中黃芪、當(dāng)歸尾、川芎、赤芍、

3、桃仁、紅花和地龍，各個藥物的理化性質(zhì)不同，采用相應(yīng)的提取溶劑和提取、純化方法進行處理，選用高效液相色譜法對君藥有效部位中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮和臣藥有效部位中阿魏酸的質(zhì)量進行控制，再按照中醫(yī)藥理論“君、臣、佐、使”的組方原則，以特定的比例組方，制備成“補陽還五顆?！薄?br>　?。ǘ┤毖灾酗L(fēng)動物模型的制備200只健康雄性SPF級大鼠，體重280～300g，適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周，稱量并記錄所有大鼠體重，隨機抽取8只做空白對照組，采用改良Pul

4、sinelli四血管閉塞法進行手術(shù)處理其余的大鼠，復(fù)制臨床缺血性中風(fēng)動物模型。
　?。ㄈ┭a陽還五顆粒治療缺血性中風(fēng)的藥效評價造模成功存活大鼠隨機分為4組，缺血性中風(fēng)模型組;缺血性中風(fēng)腦心通治療組（陽性對照組）;缺血性中風(fēng)補陽還五顆粒30.4g/kg治療組（高劑量組）;缺血性巾風(fēng)補陽還五顆粒15.2g/kg治療組（中劑量組），并設(shè)空白對照組和假手術(shù)組。灌服藥物后，所有大鼠腹主動脈取血，取2.0ml注入枸櫞酸鈉1∶9配比的抗凝管中，

5、混勻分離血漿，用Sysmex CA7000（日本），凝血酶法測定血漿纖維蛋白原的含量，用競爭性抑制法酶聯(lián)免疫吸附實驗技術(shù)測定血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)，血小板因子4(PF-4)的水平;強啡肽(Dyn)、神經(jīng)肽Y(NPY)的含量。另取2.5ml血液注入肝素鈉抗凝管1∶9的配比的抗凝管中，混勻后的全血采用賽科希德SA9000（中國，北京）全自動血液流變學(xué)分析儀測定全血還原粘度（高切、低切），全血粘度（高切、中切、低切），紅細胞沉降率、

6、紅細胞比積等，分離血漿，測定血漿粘度。其余血液注入2.0％EDTA.Na2抗凝管中，立即混勻，采用sysmex XE-5000（日本）進行血常規(guī)分析。抽完血后的大鼠，剪下頭顱，分離大腦，置于固定液中，用于病理分析。
　?。ㄋ模┘毙远拘詫嶒灲】礙M小鼠，SPF級，體重18-22g，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，實驗前4-6h禁食不禁水，采用單次口服固定劑量法進行預(yù)試驗，探明實驗下一步走向，是測LD50還是MTD。再根據(jù)預(yù)試結(jié)果安排正式實

7、驗，詳細觀察給藥動物的反應(yīng)及死亡情況，并記錄動物的外觀、行為活動、精神狀況、大小便等情況。連續(xù)觀察14天后，處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、腎、胸腺、大腦的外觀及顏色并稱取各臟器的重量計算臟器指數(shù)，并將各個臟器用10％中性甲醛固定，做病理切片進一步觀察。
　　結(jié)果：
　　（一）藥物有效部位提取物的質(zhì)控研究黃芪藥材按本實驗的方法，經(jīng)提取、粗分離和純化，測得黃芪總皂苷粗品和總黃酮類混合物的百分含量為2.83％。經(jīng)高校液相色譜法分

8、析得出，黃芪甲苷的回歸方程:y hat=1.3741x+2.9379，(R2=0.9995，r=0.9997)，總皂苷粗品和總黃酮類混合物中黃芪甲苷的含量高達6.39％;毛蕊異黃酮的回歸方程:y hat=3476.8x-4375.7，(R2=0.9996，r=0.9998)，總皂苷粗品和總黃酮類混合物中毛蕊異黃酮含量為1.34％。
　?。ǘ┤毖灾酗L(fēng)動物模型的建立采用改良Pulsinelli四血管閉塞法永久閉塞大鼠的兩條椎動脈及

9、頸總動脈后，手術(shù)大鼠眼睛發(fā)暗，甚至變黑，對外界刺激反應(yīng)變得遲鈍，翻正反射消失;毛發(fā)豎立且失去光澤，精神萎靡，動作遲緩，走路打轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈，運動時軀體向一側(cè)歪斜。同時伴有體重增長明顯減緩等癥狀，與缺血性中風(fēng)證候的臨床表現(xiàn)基本接近，表明該模型造模成功。經(jīng)檢測，血紅蛋白含量、平均RBC血紅蛋白濃度都明顯降低;血小板總數(shù)急劇增高，全血粘度和全血還原粘度，白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)等升高，血漿中神經(jīng)肽類物質(zhì)和血液因子含量也明顯升高，和空白對照組及假手

10、術(shù)組，進行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。顯微鏡下可見大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變。因此，該方法能成功復(fù)制出臨床缺血性中風(fēng)的疾病模型。
　?。ㄈ┭a陽還五顆粒治療缺血性中風(fēng)的藥效評價模型大鼠灌服補陽還五顆粒后，外觀表現(xiàn)及精神狀態(tài)都有一定程度的改善;異常降低血紅蛋白含量有所改善;異常升高的血小板總數(shù)、血漿纖維蛋白原水平、全血粘度（高切、中切、低切）和全血還原粘度（高切、低切）水平有所恢復(fù)，趨近于正常水平;同時生化因子

11、神經(jīng)肽Y(NPY)和β-血栓球蛋白(β-TG)、強啡肽(Dyn)和血小板因子4(PF4)的水平也明顯降低。大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)也有一定程度的改善。
　?。ㄋ模┘毙远拘詫嶒灲Y(jié)果在預(yù)試驗中，補陽還五顆粒藥物濃度為2000mg/kg時，經(jīng)灌胃給小鼠，當(dāng)劑量達到6g/kg時，仍不引起動物死亡，表明補陽還五顆粒無急性毒性，測不出LD50，有一個最大耐受劑量指標(biāo)，測得昆明小鼠通過灌胃服藥對補陽還五顆粒的最大耐受量高于6.0g/kg，相

12、當(dāng)于成人日劑量的82倍。給藥組小鼠的肝指數(shù)、心臟指數(shù)、肺指數(shù)、脾指數(shù)、腎指數(shù)與空白對照組相比較都無明顯的差異，表明補陽還五顆粒無明顯的靶器官毒害作用，同時安全范圍較廣。
　　結(jié)論：
　　本課題實驗中采用的改良Pulsinelli四血管閉塞法能夠成功復(fù)制臨床的缺血性中風(fēng)疾病模型，在研的補陽還五顆粒能夠改善缺血性中風(fēng)模型大鼠紊亂的血液流變系統(tǒng)，并能降低與中風(fēng)密切相關(guān)的生化因子的水平，還可以促使大腦神經(jīng)細胞的修復(fù)，從而起到對缺血性