一氧化碳通過促進(jìn)β-catenin抑制巨噬細(xì)胞活化減輕腎缺血再灌注損傷.pdf

1、背景與目的:
　　腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, renal IR)是臨床上急性腎功能衰竭主要病因，常導(dǎo)致腎臟不可逆損傷。隨著腎外傷及腎移植患者增多，防治缺血再灌注損傷已成為急需解決的難題。大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至腎臟后激活釋放出白細(xì)胞趨化因子及炎癥因子造成腎臟細(xì)胞壞死、凋亡是腎缺血再灌注損傷過程發(fā)生發(fā)展的重要因素。一氧化碳(carbon monoxide，CO)具有抗血栓和擴(kuò)張血

2、管的生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)能夠抑制炎癥細(xì)胞活化及炎癥因子釋放，其是否對(duì)腎IR具有保護(hù)作用?本實(shí)驗(yàn)旨在研究CO對(duì)小鼠腎IR損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:檢測(cè)外源性一氧化碳釋放分子(CORM-2)對(duì)小鼠腎IR的保護(hù)作用。將小鼠隨機(jī)均分為4組:假手術(shù)組（Sham組）、IR組、IR+CORM-2組和IR+iCORM-2組，檢測(cè)小鼠動(dòng)脈COHb、O2Hb濃度及血清肌酐及尿素氮水平;PAS染色觀察腎臟組織損傷;免疫組

3、化檢測(cè)腎臟MPO、F4/80的表達(dá);TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;ELISA及RT-PCR檢測(cè)腎組織的炎癥因子的分泌水平。
　　第二部分:體外檢測(cè)CORM-2對(duì)巨噬細(xì)胞的抑制作用，分離培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為4組:Cell組、LPS組、LPS+CORM-2組和LPS+iCORM-2組，MTT檢測(cè)巨噬細(xì)胞的活性;RT-PCR及ELISA檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)p65、Akt、

4、GSK-3β和β-catenin蛋白表達(dá)變化。
　　第三部分:檢測(cè)β-catenin對(duì)CORM-2抗炎作用的影響，培育特異性敲除巨噬細(xì)胞β-catenin基因小鼠，檢測(cè)敲除小鼠PM和BMDMβ-catenin基因表達(dá)水平;分別分離培養(yǎng)β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre-/-小鼠及β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為3組:Cell組、LPS組、LPS+CORM-2組，RT-

5、PCR及ELISA檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)p65和β-catenin蛋白表達(dá)變化。檢測(cè)CORM-2對(duì)特異性敲除巨噬細(xì)胞β-catenin基因小鼠腎IR的作用，將β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre-/-小鼠及β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠分為3組:Sham組、IR組、IR+CORM-2組，檢測(cè)血清肌酐及尿素氮水平;PAS染色觀察腎

6、臟組織損傷;免疫組化檢測(cè)腎臟F4/80的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)腎組織的炎癥因子的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分:CORM-2降低小鼠腎IR后血清肌酐及尿素氨水平、減少腎小管細(xì)胞損傷、壞死及凋亡、減少腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子表達(dá)水平;
　　第二部分:CORM-2減少LPS刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)、促進(jìn)Akt、GSK-3β蛋白磷酸化及β-catenin表達(dá)，抑制p65磷酸化;
　　第三部分:RT-PCR

7、結(jié)果β-cateninloxp/loxp×Lyz2Cre+/-小鼠巨噬細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平明顯降低，β-catenin敲除后巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平增加、p65磷酸化水平增加;CORM-2抑制炎癥因子表達(dá)、p65磷酸化水平減弱;β-catenin敲除后小鼠IR血清肌酐及尿素氨水平增加、腎小管細(xì)胞損傷加重、腎臟F4/80陽(yáng)性細(xì)胞及炎癥因子表達(dá)增加，CORM-2對(duì)腎功能及腎臟組織細(xì)胞保護(hù)作用減弱、