pbp1a基因與肺炎鏈球菌對青霉素耐藥的關(guān)系探討.pdf

1、目的： 探討pbpla和pbp2b基因突變與肺炎鏈球菌對青霉素耐藥的關(guān)系，進一步闡明肺炎鏈球菌耐藥性變異的機制。探討從基因水平解決肺炎鏈球菌耐青霉素等β-Lactam類抗生素變異的途徑，為臨床防治耐青霉素類抗生素的肺炎鏈球菌感染提供實驗依據(jù)。 方法： 1.從呼吸道感染患兒痰標本中分離肺炎鏈球菌，液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法測定青霉素對肺炎鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)，篩選肺炎鏈球菌耐青霉素菌株。 2.套式聚合酶

2、鏈反應(yīng)(nPCR)擴增耐青霉素菌株的pbp2b和pbpla基因。擴增產(chǎn)物DNA測序，所測序列與青霉素敏感株(SPN R6)的基因序列比較，深一步了解突變的性質(zhì)，并分析其表達蛋白的結(jié)構(gòu)變化。 3.生物合成含有STMK區(qū)的肺炎鏈球菌pbpla片段，鑒定后克隆至表達載體pUC19中，構(gòu)建含氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和β-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)的pUC19-pbpla重組質(zhì)粒。 4.利用CSP誘導(dǎo)肺炎鏈球菌感受態(tài)，轉(zhuǎn)化pUC19

3、-pbpla載體，檢測肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性。 結(jié)果： 1.從痰標本中分離出169株肺炎鏈球菌，保存中死亡6株，剩余163株，其中青霉素敏感菌75株，中度敏感菌17株，耐藥菌71株。 2.在71株耐藥菌pbp2b擴增結(jié)果中，58株存在不同位置的pbp2b突變。其中有56株為不同位置的點突變，2株為CCT插入突變，大部分出現(xiàn)于低水平耐藥中。在58株pbp2b突變株中，21株還存在pbpla突變，多存在于高水平耐

4、藥菌株中。pbp2b突變后表達的蛋白結(jié)構(gòu)改變以Thr252→Ala為主，pbpla突變后表達的蛋白結(jié)構(gòu)改變以Thr371→Ala。為主。 3.成功構(gòu)建帶有含氨芐青霉素抗性基因(Ampr)和β-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)的pbpla片段表達載體(pUC19-pbpla)，經(jīng)雙酶切測序鑒定，該重組質(zhì)粒序列無誤，基因插入方向正確。 4.成功誘導(dǎo)肺炎鏈球菌感受態(tài)，轉(zhuǎn)化pUC19-pbpla質(zhì)粒，PCR擴增測序，pbpla序列正確，無突變