IL-23、IL-27對感染免疫的影響.pdf

1、目的：IL-23、IL-27是近來發(fā)現(xiàn)的IL-12家族的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞的活性及增強(qiáng)機(jī)體抗感染免疫等生物學(xué)功能，是亞單位疫苗的潛在佐劑。在本室前期研究中，制備了針對A族鏈球菌（GAS）及呼吸道合胞病毒（RSV）的疫苗，即GAS的亞單位疫苗及DNA疫苗：重組Fba蛋白與pcDNA3.1/fba質(zhì)粒；RSV亞單位疫苗；重組G1F/M2蛋白。將兩種疫苗分別以IL-23質(zhì)粒及IL-27質(zhì)粒為佐劑接種小鼠，觀察IL-23

2、和IL-27對疫苗的免疫原性及保護(hù)性的影響，并進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.將pcDNA3.1/IL-23質(zhì)粒、pcDNA3.1/IL-27質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞行瞬時(shí)表達(dá)，Western blot檢測IL-23及IL-27的表達(dá)。同時(shí)轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc-HisB做為對照。
　　 2.大量提取pcDNA3.1/IL-23質(zhì)粒、pcDNA3.1/IL-27質(zhì)粒、pcDNA3.

3、1/myc-HisB質(zhì)粒及pcDNA3.1/fba質(zhì)粒，誘導(dǎo)并純化Fba蛋白和G1F/M2蛋白。
　　 3.動物實(shí)驗(yàn)：
　　 3.1 GAS疫苗組的動物實(shí)驗(yàn)：
　　 將雌性4周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組16只，分別為：pcDNA3.1/fba質(zhì)粒+Fba蛋白組（簡稱GAS疫苗）、GAS疫苗+IL-23質(zhì)粒組、GAS疫苗+IL-27質(zhì)粒組、IL-23質(zhì)粒組、IL-27質(zhì)粒組、PBS對照組。Fba蛋白經(jīng)皮下

4、多點(diǎn)注射，質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射進(jìn)行免疫，共免疫4次，每次間隔10d。ELISA檢測各免疫組血清IgG的動態(tài)變化水平；末次免疫后10d，每組一半動物處死，行流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟CD4+、CD8+細(xì)胞的變化；NK細(xì)胞殺傷試驗(yàn)檢測小鼠脾臟細(xì)胞殺傷活性。每組的另一半動物給予鏈球菌攻擊，以評價(jià)其對免疫小鼠的保護(hù)功效。
　　 3.2 RSV疫苗組的動物實(shí)驗(yàn)：
　　 將48只雌性4周齡BALB/c小鼠小鼠隨機(jī)分為8組，分別為：G1F/M2

5、蛋白+Al（OH）3組、G1F/M2蛋白+IL-23質(zhì)粒組、G1F/M2蛋白+IL-27質(zhì)粒組、G1F/M2蛋白+Al（OH）3+IL-23質(zhì)粒組、G1F/M2蛋白+Al（OH）3+IL-27質(zhì)粒組、G1F/M2蛋白+pcDNA3.1/myc-HisB質(zhì)粒組、G1F/M2蛋白+PBS組、PBS對照組。G1F/M2蛋白經(jīng)皮下多點(diǎn)注射，質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射進(jìn)行免疫，共免疫3次，每次間隔10d。末次免疫10天后處死小鼠，ELISA檢測各免疫組血清3

6、免后特異性IgG、IgG1和IgG2a水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟CD4+、CD8+細(xì)胞的變化；CTL殺傷試驗(yàn)檢測小鼠脾臟細(xì)胞殺傷活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.Western-blot證實(shí)IL-23質(zhì)粒、IL-27質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞并表達(dá)IL-23和IL-27。
　　 2.GAS疫苗組的動物實(shí)驗(yàn)
　　 2.1免疫后小鼠IgG水平逐漸增高，GAS疫苗組效價(jià)可達(dá)到1：12800、GAS疫苗+IL-2

7、3質(zhì)粒組效價(jià)可達(dá)到1：6400、GAS疫苗+IL-27質(zhì)粒組效價(jià)可達(dá)到1：6400，三組間效價(jià)無顯著差異。
　　 2.2流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示各組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平均較對照組顯著增高，其中IL-23質(zhì)粒加入組CD4+T細(xì)胞和CDs+T細(xì)胞水平顯著高于其他組，IL-27質(zhì)粒加入組CD4+T細(xì)胞水平顯著高于GAS疫苗組，而CD8+T細(xì)胞水平與GAS疫苗組無顯著差異。
　　 2.3體外NK細(xì)胞自然殺傷試驗(yàn)顯示：G

8、AS疫苗組、GAS疫苗+IL-23質(zhì)粒組、GAS疫苗+IL-27質(zhì)粒組殺傷率明顯高于其他三組，而三組間無明顯差異。
　　 2.4鏈球菌攻擊后，PBS組小鼠在2d內(nèi)全部死亡，而GAS疫苗組、GAS疫苗+IL-23質(zhì)粒組、GAS疫苗+IL-27質(zhì)粒組、IL-23質(zhì)粒組及IL-27質(zhì)粒組、PBS組生存率分別為43.8％、49％、57.5％、25％、18.6％、1.4％，GAS疫苗+IL-23質(zhì)粒組、GAS疫苗+IL-27組保護(hù)率較GA

9、S疫苗組顯著增高，兩組之間無顯著差異。GAS疫苗組高于IL-23質(zhì)粒組和IL-27質(zhì)粒組（P<0.05）。IL-23質(zhì)粒組和IL-27質(zhì)粒組高于PBS，組兩組之間無顯著差異。
　　 3.RSV亞單位疫苗的動物實(shí)驗(yàn)
　　 3.1免疫小鼠血清抗體效價(jià)結(jié)果顯示與PBS組相比，G1F/M2+Al（OH）3、G1F/M2+Al（OH）3+IL-23以及G1F/M2+Al（OH）3+IL-27組均誘導(dǎo)了高水平的IgG、IgG1、Ig

10、G2a抗體（P<0.05），且G1F/M2+Al（OH）3+IL-23和G1F/M2+Al（OH）3+IL-27組的抗體效價(jià)顯著高于G1F/M2+Al（OH）3組。G1F/M2+IL-27組的各種抗體水平與G1F/M2+PBS組相比無顯著性差異（P<0.05）；G1F/M2+IL-23組的抗體水平顯著低于G1F/M2+PBS組。
　　 3.2取免疫后小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水

11、平均較PBS對照組有顯著增高（P<0.05）；其中G1F/M2+IL-23和G1F/M2+Al（OH）3+IL-23刺激的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞水平顯著高于其他組（P<0.05）。這些結(jié)果表明：IL-23可以顯著刺激CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而IL-27的作用不明顯。
　　 3.3 LDH法檢測CTL對靶細(xì)胞的特異殺傷活性，各組除PBS組外均誘導(dǎo)了G1F/M2蛋白特異性CTL應(yīng)答，各組殺傷率較

12、PBS對照組明顯增高。G1F/M2+IL-23和G1F/M2+IL-27組的CTL與G1F/M2+PBS組相比沒有顯著性差異，即單獨(dú)的IL-23或IL-27對G1F/M2誘導(dǎo)的殺傷活性沒有增強(qiáng)作用；G1F/M2+Al（OH）3+IL-23和G1F/M2+Al（OH）3+IL-27組的殺傷率顯著高于G1F/M2+Al（OH）3組。
　　 結(jié)論：
　　 1.獲得成功表達(dá)IL-23、IL-27的真核質(zhì)粒。
　　 2.G

13、AS疫苗組的動物實(shí)驗(yàn)顯示
　　 IL-23質(zhì)?？梢悦黠@增強(qiáng)GAS疫苗的細(xì)胞免疫效果，而IL-27增強(qiáng)效果不明顯。二者均加強(qiáng)了疫苗的保護(hù)效果?？赡躀L-23比IL-27能更明顯的增強(qiáng)GAS疫苗的免疫效果。
　　 3.RSV疫苗組的動物實(shí)驗(yàn)表明
　　 IL-23質(zhì)粒和IL-27質(zhì)粒可以增強(qiáng)Al（OH）3的佐劑效應(yīng)。單獨(dú)IL-27質(zhì)粒不能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，而單獨(dú)IL-23抑制G1F/M2誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。IL-23可