p27抑制激素抵抗前列腺癌PC3細(xì)胞株表皮生長因子受體（EGFR）的研究.pdf

1、1941年Huggins等的開拓性工作證明,經(jīng)雙側(cè)睪丸切除后,80﹪患有轉(zhuǎn)移性或局部晚期前列腺癌的病人,在生化檢查及臨床表現(xiàn)兩方面均可獲得明顯的改善,其中10﹪的病人存活10年以上,另10﹪在6個月內(nèi)死亡,大部分病人在經(jīng)歷18～24個月后,原來為激素依賴性前列腺癌(HDPC),最終成為激素抵抗性前列腺癌(HRPC).前列腺癌一旦發(fā)展到激素抵抗階段是一個非常令人棘手的問題,盡管各國用大量的投入進(jìn)行研究但收效甚微,目前臨床上對HRPC沒有特

2、別有效的辦法.要對HRPC的治療有所突破,必須對其發(fā)病的分子機理進(jìn)行深入的研究.細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑p27主要與cyclin結(jié)合而發(fā)揮對CDK2-cyclinE的抑制作用.p27對CDK的抑制作用有兩方面,一方面p27能抑制已結(jié)合到cyclin上并被激活的CDK活性;另一方面p27也可以抑制CDK的激活過程,最終抑制細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變,故目前認(rèn)為其是一個腫瘤抑制因子<'[1]>.在前列腺癌中,大多數(shù)數(shù)據(jù)顯示隨著前列腺癌分級

3、和分期的提高,p27的表達(dá)呈進(jìn)行性下降<'[2-4]>.在正常前列腺組織和激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株中,p27表達(dá)在基線水平;但在激素抵抗性前列腺癌細(xì)胞株中,p27則失表達(dá)<'[5]>.研究發(fā)現(xiàn):外源性恢復(fù)前列腺癌細(xì)胞株中p27基因的表達(dá),可引起細(xì)胞周期被阻滯在G1期,并引起細(xì)胞凋亡增加<'[6]>.以上結(jié)果說明p27與前列腺癌進(jìn)展、由激素依賴向激素抵抗轉(zhuǎn)化存在聯(lián)系,其可能成為治療HRPC的理想靶點. EGFR在上皮、間質(zhì)、神經(jīng)源

4、性組織中都有表達(dá),其在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的增生、生長和分化中起著重要作用.研究表明:許多實體腫瘤有EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá).EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡的被抑制有關(guān)<'[7-8]>.其可能機制有:①bEGFR的高表達(dá)引起下游信號傳導(dǎo)的增強;②突變型EGFR或配體表達(dá)的增加導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化;③自分泌環(huán)的作用增強:④受體下調(diào)機制的破壞;⑤異常信號傳導(dǎo)通路的激活等<'[9-10]>.對EGFR生成的檢測有助于判斷

5、腫瘤預(yù)后,應(yīng)用抗EGFR生成治療可能會為腫瘤治療帶來進(jìn)步<'[11]>.前列腺癌一般會出現(xiàn)幾種生長因子和它們的受體過表達(dá),其中包括EGF和EGFR.EGFR在前列腺癌的生長中起了十分重要的作用,在雄激素撤退過程中它使前列腺組織對EGF家族的生長促進(jìn)作用變得十分敏感<'[12-13]>.EGFR信號級聯(lián)和HRPC的發(fā)生之間的可能聯(lián)系仍然在調(diào)查之中,但一些研究結(jié)果強烈顯示二者存在密切聯(lián)系.例如,EGFR在雄激素抵抗性前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)明

6、顯比在雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)強<'[14-15]>.旁分泌激活向自分泌激活轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致腫瘤向雄激素獨立轉(zhuǎn)態(tài)進(jìn)展<'[16]>.研究顯示EGFR信號級聯(lián)可以在缺乏雄激素的環(huán)境下激活雄激素受體.有研究結(jié)果顯示EGF和其它生長因子可能激活選擇性的信號級聯(lián),從而介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的雄激素不依懶性生長<'[17].這些結(jié)果強烈暗示:抑制EGFR信號級聯(lián)可能成為治療HRPC的理想方法. 隨著前列腺癌進(jìn)展、由激素依賴向激素抵抗?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)

7、化過程中,p27的表達(dá)漸漸下降,但EGF及EGFR的表達(dá)卻逐步升高,我們疑問這二者是否存在著一定聯(lián)系呢?國內(nèi)外文獻(xiàn)尚無相關(guān)報道,我們擬對此問題做進(jìn)一步探討. 第一部分:人類p27基因全長讀碼框 (ORF) 真核表達(dá)載體構(gòu)建 [研究目的] 為了使PC3細(xì)胞恢復(fù)p27基因的表達(dá),對p27的功能進(jìn)行較為全面的研究,我們構(gòu)建了p27基因真核表達(dá)載體及其報告基因載體.利用這套載體可以使不表達(dá)p27基因的PC3細(xì)胞獲得再表達(dá)

8、,并可以對p27基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率分析與定位. [材料與方法] PubMed查閱p27基因ORF序列,設(shè)計引物并合成.從人類正常前列腺組織內(nèi)提取RNA,然后用RT-PCR方法擴增出全長p27基因,并將其克隆到T載體.并進(jìn)一步以T載體為模板,把p27基因克隆到真核細(xì)胞高效表達(dá)的pcDNA3.1(-)載體.在構(gòu)建此載體過程中,我們把HA-Tag片斷連接在設(shè)計引物上,構(gòu)建了帶HA-Tag的p27基因.這樣有利于我們進(jìn)行鑒別外源性

9、p27表達(dá)的和HA純化.為了對p27基因進(jìn)行定位研究與轉(zhuǎn)染效率測定,我們把p270RF構(gòu)建到pEGFP-N1中. [結(jié)論] (1) 我們成功構(gòu)建了p27基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體及其報告基因質(zhì)粒載體: (2) 該套質(zhì)粒系統(tǒng)最大特點是給p27基因帶上了像標(biāo)簽一樣的HA-Tag,這樣我們可以輕松鑒別實驗中p27表達(dá)來自外源性還是細(xì)胞內(nèi)在固有.這大大增加了本實驗的科學(xué)性和嚴(yán)密性. 第二部分:p27在PC3細(xì)胞中的基

10、本生物學(xué)功能的研究 [研究目的] 為了了解p27在PC3細(xì)胞中的基本生物學(xué)功能,我們進(jìn)行了p27基因定位研究,并對p27影響PC3細(xì)胞的增殖、有絲分裂間期、凋亡細(xì)胞比例和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了深入的研究. [材料與方法] 我們將pEGFP-p27用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24小時收集細(xì)胞并用激光共聚焦方法對p27基因進(jìn)行定位.用同樣方法把pcDNA3.1-p27-HA-

11、Tag轉(zhuǎn)染至PC3細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后24,48小時時間點收集細(xì)胞,用MTT方法檢測細(xì)胞增殖;用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;用AV+PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例;用western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化. [結(jié)論] (1)p27基因定位于細(xì)胞核; (2)p27基因真核表達(dá)質(zhì)粒在PC3細(xì)胞中獲得高表達(dá); (3)p27抑制PC3細(xì)胞生長,使細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期,誘使PC3細(xì)胞凋亡增

12、加:(4)p27基因轉(zhuǎn)染組bcl-2表達(dá)下降、bax和bad表達(dá)升高、caspase-3激活和PARP劈裂片斷表達(dá)增加. 第三部分:p27對EGFR及其信號途徑影響的研究 [研究目的] 為了進(jìn)一步研究p27抗腫瘤作用是否與EGFR的表達(dá)水平及其信號級聯(lián)有關(guān),我們對EGFR的表達(dá)、P13K/Akt,NF-κ B,PLcγ和Raf-1MFK/MAPK信號級聯(lián)進(jìn)行了分析研究. [材料與方法] 我們使用

13、pcDNA3.1-p27-HA-Tag對PC3細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,以空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組為對照.在轉(zhuǎn)染后24,48小時時間點收集細(xì)胞并行蛋白裂解,用westem blot分析EGFR的表達(dá)變化.同時我們?yōu)榱诉M(jìn)一步分析p27對EGFR信號級聯(lián)的影響,還分析了P13K(p85)、Akt和p-Akt(S473)的表達(dá).同時還對NF-κB,PLcr和Raf-1/MEK/MAPK信號級聯(lián)進(jìn)行了分析研究.蛋白表達(dá)變化用Kodark光密度分析軟