HBV核心抗原與前S1抗原基因的融合表達及其對轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫治療作用.pdf

1、研究背景 乙型肝炎病毒(HBV)感染在世界范圍內(nèi)流行，全球大約30％的人口感染HBV，每年至少有100萬慢性感染的病人死于慢性肝臟疾病，包括肝硬化和肝癌。我國有1.2億乙型肝炎表面抗原攜帶者，有2000萬慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)病人。尋找治療慢乙肝、慢性病毒攜帶者的治療方法是急需解決的問題。 目前用于慢乙肝治療的藥物豐要有抗病毒藥物和免疫機能調(diào)節(jié)藥，前者包括核苷酸類似物如拉米呋啶，后者包括胸腺肽和左旋咪唑以及具有抗病

2、毒作用的干擾素。這些藥物不儀效果不盡人意，而且價格昂貴，副作用大。隨著對乙肝發(fā)病機理研究的深入，人們已經(jīng)認識到宿主對HBV的免疫耐受是慢乙肝發(fā)病的關(guān)鍵。利用含HBV表面抗原和核心抗原基因的疫苗免疫能有效的激活機體的特異性體液免疫和細胞免疫。治療性疫苗可能成為慢乙肝治療的新突破。 比較早已熟知用于乙肝預(yù)防免疫的HBV表面抗原(HBsAg)疫苗，近年來人們對HBV核心抗原(HBcAg)在HBV免疫中的地位越來越重視?，F(xiàn)已證明HBcA

3、g在自限性HBV感染病人中是一個Th細胞的重要靶子，而在慢性HBV感染病人中這種針對HBcAg的Th細胞反應(yīng)很低或消失。用編碼HBcAg的DNA疫苗免疫小鼠可激發(fā)MHC-I類限制性CTL，從而參與病毒的清除。乙型肝炎病毒對肝細胞受體的相應(yīng)配體存在于前S1(21～47)氨基酸多肽部分，前S1蛋白的免疫原性比HBsAg為強，因此提示前S1/前S2可能具有改進現(xiàn)用疫苗的保護性。 研究目的 1、表達可用于乙型肝炎治療性疫苗研究的

4、乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)與前S1抗原(PreS1)氨基酸(AA)3—55肽段融合蛋白(HBVCS1)。 2、觀察融合蛋白抗原HBVCS1誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答情況。 3、觀察融合蛋白疫苗HBVCS1在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫治療效果。 研究方法 1、以原核表達載體pET-lld表達HBV融合蛋白，采用免疫印跡技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分析表達產(chǎn)物的抗原性。 2、實驗組和

5、對照組小鼠(Balb/c)，分別腹腔內(nèi)注射融合蛋白抗原HBVCS1與免疫佐劑(弗氏不完全佐劑和弗氏完全佐劑)，對照組小鼠儀注射弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。采用酶連免疫吸附方法檢測抗原接種前后血清中抗-HBc及其亞類和抗-PreS1。 3、16只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠分成兩組，在0周和3周時實驗組小鼠腹腔內(nèi)注射HBVCS1與免疫佐劑(弗氏完全佐劑/弗氏不完全佐劑)，對照組儀注射弗氏完全佐劑與磷酸鹽緩沖液PBS。采用<'3>H-TdR摻

6、入法檢測轉(zhuǎn)基因鼠脾淋巴細胞特異性增殖反應(yīng)，以酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中的乙肝病毒表面抗原HBsAg，采用熒光定量PCR檢測血清中的HBVDNA。 結(jié)果 1、HBV融合蛋白在大腸桿菌中有效穩(wěn)定表達，表達產(chǎn)物具有核心抗原和前S1特異抗原性。 2、實驗組小鼠有高滴度的抗-HBc 和抗-PreS1產(chǎn)生，隨免疫時間增長，抗-HBc滴度與抗原量正相關(guān)(P<0.05)，與佐劑(弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑)的使用無關(guān)(P>0.

7、05)。對照組無特異性抗體產(chǎn)牛。在所抗-HBc IgG亞類中，以IgG2a占優(yōu)勢(IgG2a/IgG1>1)，提示小鼠在免疫后均傾向于產(chǎn)生。IgG2a占優(yōu)勢的Th1型輔助性T細胞應(yīng)答。 3、實驗組(1.99±0.347)轉(zhuǎn)基因鼠脾細胞抗原特異性增殖反應(yīng)明顯高于對照組(1.56±0.149)；實驗組第6周(3.58±0.80)與第9周(3.45±0.70)血清中HBsAg終點滴度與第 1 周(4.36±1.04)及第3周(4.81

8、±0.98)以及同一時間實驗組與對照組之間HBsAg終點滴度均有顯著性差別；實驗組小鼠第6周(4.02±0.29)和第9周(3.58±0.17)血清中HBVDNA含量明顯低于免疫前(5.55±0.88)，而對照組各批血清無此差別。 結(jié)論 1、方法有效表達了HBV融合蛋白，表達產(chǎn)物具有特異抗原性。融合蛋白的表達為進一步進行HBVCS1融合蛋白作為疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 2、乙型肝炎病毒核心前S1融合蛋白抗原對小鼠很好